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（D-精氨酸，D-苯丙氨酸⁵,D-Trp⁷·⁹,Leu´´）-最初被描述为低效力胃饥饿素受体拮抗剂的物质P出人意料地被发现是一种完全反向激动剂（EC₅₀ = 5.2 nM）。在用胃促生长素受体瞬时转染的COS-7细胞中，物质P类似物rPKPfQwFwLL将组成型信号传导降低到未转染细胞中观察到的水平。假设胃促生长素受体的组成型信号传导在食欲控制的调节中具有生理相关性，胃促生长素接收器的反向激动剂可能对治疗肥胖感兴趣。因此，Asakawa等人发现，外周给药H-6395降低了瘦小鼠、饮食诱导肥胖小鼠和肥胖小鼠的食物摄入量。

(D-Arg¹,D-Phe⁵,D-Trp⁷·⁹,Leu¹¹)-Substance P initially described as a low potency ghrelin receptor antagonist has surprisingly been found to be a full inverse agonist (EC₅₀ = 5.2 nM). In COS-7 cells transiently transfected with the ghrelin receptor the substance P analog rPKPfQwFwLL decreased the constitutive signaling down to levels observed in untransfected cells. Assuming that constitutive signaling of the ghrelin receptor is of physiological relevance in the regulation of appetite control, inverse agonists of the ghrelin receptor could be interesting for the treatment of obesity. So, Asakawa et al. found that peripherally administered H-6395 decreased food intake in lean mice, in mice with diet induced obesity, and in ob/ob obese mice.

[D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7,9，Leu11]-物质P醋酸盐是一种广谱的神经肽反向激动剂和拮抗剂。它作为胃促生长素受体的完全反向激动剂（EC50=5.2 nM）和速激肽、缓激肽、CCK和蛙皮素受体的拮抗剂。在体外诱导癌症细胞凋亡并抑制其生长。

[D-Arg1,D-Phe5,D-Trp7,9,Leu11]-Substance P acetate is a broad-spectrum neuropeptide inverse agonist and antagonist. It acts as a full inverse agonist for the ghrelin receptor (EC50 = 5.2 nM) and antagonist at tachykinin, bradykinin, CCK, and bombesin receptors. It induces apoptosis and inhibits cancer cell growth in vitro.

很多蛋白在细胞中非常容易被降解，或被标记，进而被选择性地破坏。但含有部分D型氨基酸的多肽则显示了很强的抵抗蛋白酶降解能力。

定义
物质P（SP）是十一肽，在周围和中枢神经系统中都丰富，通常与一种经典的神经递质之一，最常见的是血清素（5-HT）^1共定位。

相关肽
SP属于神经肽家族，称为速激肽，具有共同的C端序列：Phe-X-Gly-Leu-Met-NH ₂。三种最常见的速激肽是SP，神经激肽A（NKA）和神经激肽B（NKB）。它们的生物学作用是通过称为NK1，NK2和NK3的特定细胞表面受体介导的，其中SP是NK1受体的首选激动剂，NKA是NK2受体的首选激动剂，NKB是NK3受体的²激动剂。

Discovery
SP最初是由冯·欧拉（von Euler）和加德姆（Gaddum）于1931年发现的，是一种引起体外肠道收缩的组织提取物。在随后的几十年中，它的生物活性和组织分布得到了进一步的研究³。

结构特征
SP是具有11个残基的神经肽，序列为Arg-Pro-Lys-Pro-Gln-Glin-Phe-Gly-Leu-Met-NH ₂）⁴。在一项研究中，将SP的C和N末端片段与母体分子在以下方面的能力进行了比较：（a）收缩分离的豚鼠回肠，（b）在大鼠中诱导唾液分泌，（c）激发单只猫背角神经元，以及（d）通过小鼠颅内注射诱导抓挠。在所有测定系统中，与七肽一样小的C末端片段都是有效的SP激动剂。包含五个或更少氨基酸的C末端片段至多仅具有弱活性。N-末端片段在分离的豚鼠回肠上完全没有活性。然而，在大鼠唾液分泌和中枢神经系统分析中，N末端片段具有弱的SP样活性⁵。获得的结果表明，尽管SP的羧基末端对于肽支气管活性是必不可少的，但是氨基末端肽的丢失（最多四个残基）实际上增强了对肽的支气管收缩剂反应。这种增强的一部分似乎是由SP和SP5-11的酶促降解差异引起的。数据表明，二肽基氨基肽酶对SP的切割可以增强其生物活性⁶。SP类似物：Senktide（琥珀酰-[Asp6，Me-Phe8] SP-（6-11））是NK-3（SP-N）受体的选择性类似物，效力比SP高20-100倍，约为1000倍比为NK-1（SP-P）受体选择性类似物，其驻留在肌肉细胞更有效的⁷。鞘内注射后研究了5种SP类似物对神经激肽（NK）1受体激动剂如SP，藻蛋白和（p-Glu6，Pro9）-SP（6-11）（肽）诱导的舔，咬和scratch痒反应的影响。在小鼠中。肽引起类似SP的行为反应，其效力是D-Pro9类似物D-肽的25倍。（D-Arg1，D-Pro2,4，D-Phe7，D-His9，Leu11）-SP的剂量低于（D-Phe7，D-His9，Leu11）-SP的肽诱导的应答（6 -11）。相反，（D-Arg1，D-Pro2,4，D-Phe7，D-His9）-SP（0.5-1.0 nmol）和（D-Phe7，D-His9）-SP（6-11）（0.5- 2.0 nmol）仅抑制SP诱导的行为反应，而不抑制physalaemin或肽诱导的反应。⁸。P物质[D-Arg1，D-Phe5，D-Trp7,9，Leu11] SP（SpD）和[Arg6，D-Trp7,9，NmePhe8]类似物P可以抑制神经肽刺激的Ca2 +动员，酪氨酸磷酸化和ERK激活。至关重要的是，SpD和[Arg6，D-Trp7,9，NmePhe8] SP在体内和体外均抑制SCLC细胞生长并刺激SCLC细胞凋亡。SP类似物最初被表征为“广谱神经肽拮抗剂” ⁹。

作用方式
SP受体是一种G蛋白偶联受体，在许多方面与精神病学中其他经过充分研究的受体相似，特别是单胺受体²。SP与其受体的相互作用激活了Gq，Gq又激活了磷脂酶C，将磷脂酰肌醇双磷酸酯分解为肌醇三磷酸酯（IP3）和二酰基甘油（DAG）。IP3作用于肌质网中的特定受体以释放Ca2 +的细胞内储存，而DAG通过蛋白激酶C作用以打开质膜中的L型钙通道。细胞内[Ca2 +]的升高诱导组织反应。与SP所见的一系列动作一样，存在多种治疗可能性¹⁰。

功能
在中枢神经系统中，SP与情绪障碍，焦虑，压力，增强，神经发生，神经毒性和疼痛的调节有关。在消化道，SP，以及一些其他速激肽，是神经递质，调节运动活动，离子和液体的分泌，以及血管功能^11，12。

参考

1. Argyropoulos SV, Nutt DJ (2000). Substance P antagonists: novel agents in the treatment of depression. Expert Opin Investig Drugs,  9(8):1871-1875.
2. Book: Substance P and Related Tachykinins. Chapter 13: Neuropsychopharmacology: By Nadia MJ, Kramer MS.
3. Senba E, Tohyama M (1985). Origin and fine structure of substance P-containing nerve terminals in the facial nucleus of the rat:an immunohistochemical study. Exp Brain Res., 57(3):537-546.
4. Seidel MF, Tsalik J, Vetter H, Müller W (2007). Substance P in Rheumatic Diseases. Current Rheumatology Reviews, 3:17-30.
5. Piercey MF, Dobry PJ, Einspahr FJ, Schroeder LA, Masiques N (1982) Use of substance P fragments to differentiate substance P receptors of different tissues. Regulatory Peptides, 3(5-6):337-349.
6. Shore SA, Drazen JM (1988). Airway responses to substance P and substance P fragments in the guinea pig. Pulm Pharmacol., 1(3):113-118.
7. Hanani M, Chorev M, Gilon C, Selinger Z (1988). The actions of receptor-selective substance P analogs on myenteric neurons: an electrophysiological investigation. European journal of pharmacology, 153(2-3):247-253.
8. Sakurada T, Yamada T, Tan-no K, Manome Y, Sakurada S, Kisara K, Ohba M (1991). Differential effects of substance P analogs on neurokinin 1 receptor agonists in the mouse spinal cord. J Pharmacol Exp Ther.,  259:205-210
9. MacKinnon AC, Waters C, Jodrell D, Haslett C, Sethi T (2001). Bombesin and Substance P Analogues Differentially Regulate G-protein Coupling to the Bombesin Receptor. J. Biol. Chem.,   276(30):28083-28091..
10. Khawaja AM, Rogers DF (1996). Tachykinins: receptor to effector. Int J Biochem Cell Biol.,  28(7):721-738.
11.  Leeman SE, Mroz EA (1974).  Substance P. Life Sci., 15(12):2033–2044.
12. Wiesenfeld-Hallin Z, Xu XJ (1993). The differential roles of substance P and neurokinin A in spinal cord hyperexcitability and neurogenic inflammation. Regul Pept., 46(1-2):165-173

多肽H2N-DArg-Pro-Lys-Pro-DPhe-Gln-DTrp-Phe-DTrp-Leu-Leu-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克的MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取1.55g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.4mmol Fmoc-Leu-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入2.79mmol DIPEA，1.33mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Leu-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

Fmoc-DArg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-DArg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-DPhe-Gln(Trt)-DTrp(Boc)-Phe-DTrp(Boc)-Leu-Leu-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-DArg-Pro-Lys-Pro-DPhe-Gln-DTrp-Phe-DTrp-Leu-Leu-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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