专肽生物_定制多肽合成服务_多肽合成定制服务_多肽合成厂家_多肽合成公司

多肽荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛，多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时，这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。
        人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        专肽生物能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。
 

下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构：




FITC标记
 

      FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性，我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽 上：(1) 将FITC标记于赖氨酸（Lys）或被选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链氨基 上；(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。

      当在N端标记时，建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入 烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC 的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器 如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。空间位阻 被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

普通荧光修饰

通过Lys侧链氨基连接的荧光修饰

专肽常做的荧光物质的激发光波长和发射光波长。可供参考选择：
 

定义

基质金属蛋白酶（MMP）属于锌内肽酶家族，统称为metzincins。metzincin超家族的特征是高度保守的基序，该基序包含在催化位点与锌结合的三个组氨酸和位于活性位点下方的保守的蛋氨酸。

发现

间质胶原酶，首先被确定的MMP家族成员，最初是在旨在解释designed变态为青蛙1的胶原重塑的实验中发现的。MMP家族由20多个共享相同功能域的相关锌依赖性酶组成。这些酶既具有通常基于优选底物的描述性名称，又具有基于发现顺序的MMP编号系统1。

结构特征

MMP的基本结构由以下同源结构域组成：1）将MMP引导至分泌或质膜插入途径的信号肽；2）前结构域，通过占据活性位点锌使酶具有潜伏期，使底物难以接近催化酶；3）含锌的催化域；4）溶血毒素域，介导与底物的相互作用并赋予酶特异性；5）连接催化和血红蛋白结构域的铰链区。MMP7或基质溶素是最小的MMP，缺少血红素结构域，但在底物降解中表现出特异性。额外的结构域和底物特异性导致MMP分为亚组。

MMP的蛋白质结构中两个序列基序高度保守。在所有MMP的催化域中发现的共有基序HExGHxxGxxH，包含3个与活性中心的锌离子（Zn）配位的组氨酸。PRCGxPD基序位于MMPs前结构域的C末端；该基因座的半胱氨酸残基（C）与活性中心的锌原子的配位赋予了酶2、3潜伏期。

行动方式

MMP的体内活性在几个水平上受到严格控制。这些酶通常以极低的量表达，其转录受到细胞因子和生长因子（如白介素（IL-1，IL-4，IL-6），转化生长因子（EGF，HGF，TGFβ）的正向或负向严格调控。 ），或肿瘤坏死因子α（TNFα的）4， 5。这些调节分子中的一些可以被MMP蛋白水解激活或失活（反馈作用）。转录后，MMP活性受到位于新合成的酶的N末端的前肽所赋予的潜伏期的限制。从细胞分泌后，MMPs的激活取决于前结构域与催化位点的相互作用的破坏，这可能通过前结构域的构象变化或蛋白水解去除而发生。在其前肽中含有弗林蛋白酶样识别结构域的MMP（MMP11，MT-MMP，MMP28）可以通过枯草杆菌蛋白酶丝氨酸蛋白酶家族的成员在反式高尔基体网络中被激活。MMP14在细胞表面的proMMP2激活中起着不可或缺的作用。分泌的MMP的胞外蛋白水解激活可以通过丝氨酸蛋白酶（如纤溶酶）介导，这暗示着这两个酶基团在ECM重塑中具有相互依赖性。某些活动的MMP可以激活其他proMMP，例如MMP9和MMP1的MMP3激活。激活后，MMP会受到内源性抑制剂，自降解和选择性内吞作用的进一步调节。已经证明通过低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP）机制内吞MMP2、9和137。

功能

MMP参与癌症的各个方面-MMP诱导的肝素结合上皮生长因子，胰岛素样生长因子和成纤维细胞生长因子从细胞表面释放（脱落），促进细胞增殖。另一方面，由MMP释放和激活ECM螯合的TGFβ可以导致细胞增殖受到抑制。

炎症性疾病-许多报道暗示MMP1，MMP3和MMP9参与类风湿和骨关节炎。

心血管疾病-大量研究表明，动脉粥样硬化和动脉瘤形成部位6的MMP，尤其是MMP9水平升高。已经提出MMP代表冠状动脉疾病患者中炎症的敏感标志。

肺部疾病- MMP的水平升高已经牵涉在各种肺部疾病，包括急性呼吸窘迫综合征，哮喘，支气管扩张和囊性纤维化的病理生理学。MMP，EMMPRIN和TIMPs是由肺中的许多常驻细胞产生的，因此使它们在疾病中的作用7的分析变得复杂。

中枢神经系统疾病-在观察到MMP9在类似于多发性硬化症和格林-巴利综合症的动物模型中的关键作用之后，MMPs参与了几种不同类型的神经系统疾病。

休克综合征- MMP8和MMP9存储在多形核白细胞的颗粒。这些细胞是炎症和感染过程中的关键效应器。这些MMP在休克中的作用得到了对MMP9缺陷型小鼠的研究的支持，这些小鼠被证明对内毒素休克具有抗性。Dubois等人[ 8]提出，特定的MMP9抑制作用是治疗败血性休克综合症的一种潜在方法。 

参考

1.     Gross J, Lapiere CM (1962). Collagenolytic activity in amphibian tissues; a tissue culture assay. PNAS., 48:1014-1022.

2.     Nagase H, Woessner F (1999). Matrix metalloproteinases. J Biol Chem., 274(31):21491-21494.

3.     Birkedal-Hansen H. (1995). Proteolytic remodeling of extracellular matrix. Curr Opin Cell Biol., 7:728-735.

4.     Zucker S, Pei D, Cao J, Lopez-Otin C (2003). Membrane type-matrix metalloproteinases (MT-MMP). Cell Surface Proteases., 54:1-74.

5.     Yang Z, Strickland DK, Bornstein P (2001). Extracellular MMP-2 levels  are regulated by the low-density lipoprotein-related scavenger receptor and thrombospondin. J Biol Chem., 276: 8403-8408.

6.     Van den Steen PE, Dubois B, Nelissen I, Rudd PM, Dwek RA, Opdenakker G (2002). Biochemistry and molecular biology of gelatinase B or matrix metalloproteinase-9 (MMP-9). Crit Rev Biochem Mol Biol,. 37:376-536.

7.     Haseneen N, Vaday G, Zucker S, Foda HD (2003). Mechanical stretch induces MMP-2 release and activation in lung endothelium: role of EMMPRIN. Am J Physio Lung Cell Mol Physiol., 165:541-547.

8.     Dubois B, Starckx S, Pagenstecher A, Oord J, Arnold B, Opdenakker G. Gelatinase B (2002). Deficiency protects against endotoxin shock. Eur J Immunol., 32:2163-2171.

多肽DABCYL-Gaba-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取2.19g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.97mmol Fmoc-Lys(Boc)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.94mmol DIPEA，1.87mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入1.97mmol 4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)到树脂中，再加入3.94mmol DIPEA、1.87mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到DABCYL-Gaba-Arg(Pbf)-Pro-Lys(Boc)-Pro-Val-Glu(OtBu)-Nva-Trp(Boc)-Arg(Pbf)-Glu(Edans)-Ala-Lys(Boc)-Linker-MBHAResin。 结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品DABCYL-Gaba-Arg-Pro-Lys-Pro-Val-Glu-Nva-Trp-Arg-Glu(Edans)-Ala-Lys-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

以上所有内容，为专肽生物原创内容，请勿发布到其他网站上。