分子医学研究所发明低光毒性线粒体荧光探针,助力活细胞超分辨成像与干细胞分选
近日,北京大学分子医学研究所的陈知行课题组报道了新型线粒体染料PK Mito Red 和 PK Mito Deep Red,首次在活细胞水平上实现了成像探针光毒性的明显降低。通过与分子医学所陈良怡课题组和西湖大学雷凯课题组合作,实验表明新染料在各种成像条件下对细胞的光毒性显著低于MitoTracker系列商业染料,也可以用于涡虫干细胞流式分选,具有全面的高生物相容性。该工作于7月29日以Cyclooctatetraene-conjugated cyanine mitochondrial probes minimize phototoxicity in fluorescence and nanoscopic imaging 为题,在线发表在Chemical Science上。
图1 新型探针的结构、光谱和在HeLa细胞中的光毒性
线粒体是细胞重要的能量中心和代谢调控中心,其结构高度动态,研究非常依赖荧光成像实验。现有的商用荧光探针亮度和定位虽然经过系统优化,但光毒性仍然很强,不能满足长时间荧光成像,特别是近年来快速发展的超分辨荧光成像的要求。为了最大程度抑制探针产生三线态进而产生ROS的过程,从而减少光毒性,团队采用了之前应用于染料激光、单分子成像等领域减少光漂白的分子内缀合三线态淬灭剂(自修复染料 self-healing dye)的策略。通过HeLa细胞的光照存活实验找到了有效降低光毒性的环辛四烯(COT)基团,而后合成了两种以Cyanine为母核,缀合COT的荧光探针PK Mito Red (PKMR)和 PK Mito Deep Red(PKMDR)。新探针在各种成像实验中都表现出极低的光毒性。例如在对光毒性极为敏感的大鼠心肌细胞的3D四色成像实验中,商业染料MitoTracker Deep Red标记的细胞在5-8帧后就会发生线粒体损伤、细胞收缩死亡,而使用新探针PK Mito Deep Red 标记的细胞在相同条件下,可以进行20帧以上的四色成像,光毒性降低3倍以上,可观测到更多动态信息。
图2 新型探针在显微成像中展示了低光毒性(左侧 COS7细胞Hessian-SIM超分辨成像,右侧 大鼠心肌细胞3D 共聚焦成像)
在Hessian-SIM超分辨成像体系中,新探针在展示了清晰的线粒体嵴结构图像的同时,最大程度的保留了线粒体的原始形态。使用商业染料MitoTracker Red CMXRos (MTR)标记的线粒体在140帧左右就发生了肿胀和明显形变,200帧以上已不可见嵴等正常生理结构,而PKMR标记的线粒体可以提供1000帧(10 fps)以上的健康线粒体图像 ,第2000帧左右线粒体的形变程度仍小于商业探针相应的第200帧图像。
团队还测试了新探针在流式细胞分选和原代成体干细胞中的应用。在涡虫的干细胞分选实验中,团队发现PKMR标记线粒体可以帮助分选出干细胞群,而MTR分选则效果不佳。同时,PKMR标记的干细胞在体外仍能维持较好的活性和干性,在移植回无干细胞涡虫后仍然能够增殖分化。因此,新探针展示了在流式荧光分析分选中优秀的生物相容性,能够极大助力干细胞研究相关的生物应用。
这项工作的完成离不开北京大学分子医学所在线粒体和生物成像领域的战略布局,使得探针技术,显微镜技术以及科学问题能够相互启发,紧密合作。成果凝聚了杨中天(北京大学分子医学所研究助理,共同一作),李柳菊(北京大学分子医学所博士研究生,共同一作)等团队成员的辛勤工作,也得到了国家自然科学基金,生命科学联合中心,西湖大学,北大超算平台,分子所质谱平台,和北京大学分子医学南京转化院等单位的大力支持与资助。陈知行课题组大量制备了PK Mito探针,欢迎有需要的课题组联系合作,利用新工具探索线粒体动态结构和生物学功能。
原文链接:
https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/sc/d0sc02837a#!divAbstract
课题组网站:
陈知行:
https://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/64639.htm
陈良怡:
https://www.imm.pku.edu.cn/kytd/rcdw/24147.htm
雷凯:
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