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PKG Substrate 是一种 cGMP 依赖性的蛋白激酶 (PKG) 的选择性底物。

PKG Substrate is a selective substrate for cGMP-dependent protein kinase (PKG).

"Peptide H-RKRSRAE-OH is a Research Peptide with significant interest within the field academic and medical research. Recent citations using H-RKRSRAE-OH include the following: Isotope-coded, fluorous photoaffinity labeling reagents Z Song, W Huang , Q Zhang - Chemical communications, 2012 - pubs.rsc.orghttps://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2012/cc/c2cc00027j Control of serotonin transporter phosphorylation by conformational state YW Zhang, BE Turk , G Rudnick - Proceedings of the , 2016 - National Acad Scienceshttps://www.pnas.org/doi/abs/10.1073/pnas.1603282113 Dopamine-derived biological reactive intermediates and protein modifications: Implications for Parkinsons disease Y Jinsmaa, VR Florang, JN Rees, LM Mexas - Chemico-biological , 2011 - Elsevierhttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009279711000111 Fluorous Photoaffinity Labeling to Probe Protein-Small Molecule Interactions W Huang , Q Zhang - Chemical Biology: Methods and Protocols, 2015 - Springerhttps://link.springer.com/protocol/10.1007/978-1-4939-2269-7_20 Desensitization of PKA-stimulated ciliary beat frequency in an ethanol-fed rat model of cigarette smoke exposure TA Wyatt , MJ Gentry-Nielsen, JA Pavlik - Alcoholism: Clinical , 2004 - Wiley Online Libraryhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1097/01.ALC.0000130805.75641.F4 Both cAMP and cGMP are required for maximal ciliary beat stimulation in a cell-free model of bovine ciliary axonemes TA Wyatt , MA Forgacašt, JM Adams - American Journal of , 2005 - journals.physiology.orghttps://journals.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajplung.00107.2004 Ethanol stimulates ciliary beating by dual cyclic nucleotide kinase activation in bovine bronchial epithelial cells TA Wyatt , MA Forgacašt, JH Sisson - The American journal of pathology, 2003 - Elsevierhttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S000294401063475X Malondialdehyde-acetaldehyde-adducted bovine serum albumin activates protein kinase C and stimulates interleukin-8 release in bovine bronchial epithelial cells TA Wyatt , KK Kharbanda, DJ Tuma, JH Sisson - Alcohol, 2001 - Elsevierhttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S074183290100177X Regulation of ciliary beat frequency by both PKA and PKG in bovine airway epithelial cells TA Wyatt , JR Spurzem, K May - American Journal of , 1998 - journals.physiology.orghttps://journals.physiology.org/doi/abs/10.1152/ajplung.1998.275.4.l827 Modulation of the effector functions of cytolytic t-lymphocytes with synthetic peptide inhibitors of protein kinases RE Taffs, MV Sitkovsky - Journal of pharmaceutical sciences, 1992 - Wiley Online Libraryhttps://onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/jps.2600810108 A catalytically inactive mutant of type I cGMP-dependent protein kinase prevents enhancement of large conductance, calcium-sensitive K+ channels by sodium RD Swayze, AP Braun - Journal of Biological Chemistry, 2001 - ASBMBhttps://www.jbc.org/article/S0021-9258(19)40399-2/abstract Mass spectrometry of self-assembled monolayers: a new tool for molecular surface science M Mrksich - ACS nano, 2008 - ACS Publicationshttps://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/nn7004156 Parkinsons disease and a dopamine-derived neurotoxin, 3, 4-Dihydroxyphenylacetaldehyde: implications for proteins, microglia, and neurons LL Eckert - 2012 - iro.uiowa.eduhttps://iro.uiowa.edu/view/pdfCoverPage?instCode=01IOWA_INST&filePid=13730805310002771&download=true Antibody specific for phosphorylated AMPA-type glutamate receptors at GluR2 Ser-696 K Nakazawa , T Tadakuma, K Nokihara, M Ito - Neuroscience research, 1995 - Elsevierhttps://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0168010295009779 Electron capture dissociation mass spectrometric analysis of lysine-phosphorylated peptides K Kowalewska, P Stefanowicz , T Ruman - Bioscience , 2010 - portlandpress.comhttps://portlandpress.com/bioscirep/article-abstract/30/6/433/55879 Protein reactivity of 3, 4-dihydroxyphenylacetaldehyde, a toxic dopamine metabolite, is dependent on both the aldehyde and the catechol JN Rees, VR Florang, LL Eckert - Chemical research in , 2009 - ACS Publicationshttps://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/tx9000557 Lipid peroxidation products inhibit dopamine catabolism yielding aberrant levels of a reactive intermediate JN Rees, VR Florang, DG Anderson - Chemical research in , 2007 - ACS Publicationshttps://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/tx700248y A phenylalanine in peptide substrates provides for selectivity between cGMP-and cAMP-dependent protein kinases. 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 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽H2N-Arg-Lys-Arg-Ser-Arg-Ala-Glu-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取0.57g CTC Resin（如初始取代度约为0.53mmol/g）和0.36mmol Fmoc-Glu(OtBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入0.91mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Glu(OtBu)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Glu(OtBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取0.91mmol Fmoc-Ala-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入1.81mmol DIPEA，0.86mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Glu(OtBu)-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Arg-Lys-Arg-Ser-Arg-Ala-Glu-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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