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专注多肽 服务科研
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FRET底物DABCYL-LAQAVRSSR-EDANS代表了高效荧光猝灭的最佳尺寸，同时结合所有必要的氨基酸以产生一种活性底物，用于快速筛选抑制TNF-α转化酶（TACE，ADAM17内肽酶）活性的化合物。
编号：174424
CAS号：396716-14-6
单字母：Dabcyl-LAQAVRSSSR-EDANS
FRET底物DABCYL-LAQAVRSSR-EDANS代表了高效荧光猝灭的最佳尺寸，同时结合所有必要的氨基酸以产生一种活性底物，用于快速筛选抑制TNF-α转化酶（TACE，ADAM17内肽酶）活性的化合物。
The FRET substrate DABCYL-LAQAVRSSSR-EDANS represents the optimal size for efficient fluorescent quenching, while incorporating all of the necessary amino acids to yield a viable substrate to be used for rapid screening of compounds for inhibition of TNF-α converting enzyme (TACE, ADAM17 endopeptidase) activity.
TNF-a is shed from cell membranes by TNF-a-FW cleaving enzyme (TACE). Incubation of the TACE substrate with recombinant human TACE gives a specific cleavage to restore the quenched fluorescence. The substrate is widely used to screen inhibitors of TNF-α converting enzyme (TACE, ADAM17 endopeptidase) activity. On application is its use as a TACE FRET Substrate I and it is available as a Trifluoroacetate Salt.
DABCYL-TNF-alpha-EDANS (-4 to +6) (human) trifluoroacetate salt is a fine chemical that has been shown to be useful in research. It is a versatile building block for the synthesis of complex compounds and can be used as a reaction component for the synthesis of speciality chemicals. The compound is a high quality reagent, which can be used as an intermediate for the synthesis of other chemical compounds.
DABCYL标记说明
4-(4-二甲氨基苯基偶氮)苯甲酰基（Dabcyl）是一种发色团，常与荧光团（如EDANS）结合用作猝灭剂。Dabcyl/EDANS FRET（荧光共振能量转移）对的福斯特半径为3.3纳米。
4-(4-Dimethylaminophenylazo)benzoyl (Dabcyl) is a chromophor often used as a quencher in conjunction with a fluorophore (e.g., EDANS). Dabcyl/EDANS FRET pair have a Forster radius of 3.3 nm.
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Glossary: EDANS
5-[(2-Aminoethyl)amino]naphthalene-1-sulfonyl (EDANS) is fluorophor with an excitation at 340 nm ▉ and emission of 490 nm ▉. EDANS is often paired together with acceptors like dabcyl for FRET experiements.
Properties of Hemoglobin Decolorized with a Histidine-Specific Protease.
Shi, Jing, et al. Journal of Food Science 80.6 (2015): E1202-E1208.
| DOI | 名称 | |
|---|---|---|
| 10.1515/BC.2002.205 | Application of peptides containing the cleavage sequence of pro-TNFalpha in assessing TACE activity of whole cells | 下载 |
| 10.1021/bi0361766 | Identification of novel inhibitors of the SARS coronavirus main protease 3CLpro | 下载 |
| 10.1016/j.ab.2003.12.035 | Characterization of Mca-Lys-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2, a fluorogenic substrate with increased specificity constants for collagenases and tumor necrosis factor converting enzyme | 下载 |
多肽DABCYL-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-EDANS的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取2.77g CTC Resin（如初始取代度约为0.7mmol/g）和2.33mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入5.82mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取5.82mmol Fmoc-Ser(tBu)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入11.63mmol DIPEA，5.53mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
H2N-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
Fmoc-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin，结构如下：
5、4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入5.82mmol4-二甲胺偶氮苯-4’-羧酸(DABCYL)到树脂中，再加入11.63mmol DIPEA，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到DABCYL-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin。 结构如下：
6、全保护切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液体积约为树脂体积的3倍。再次用DCM洗涤树脂2遍（去除残留DMF），后将配置好的溶液倒入到反应器中，反应30分钟。抽滤树脂，收集滤液（此时多肽已经从树脂上分离，存在于滤液中）。多肽序列为 DABCYL-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-CTC Resin。 在滤液中添加DIEPA，调PH至7-8。用饱和NaHCO3洗涤滤液，分离出DCM层溶液。可适当旋蒸DCM层溶液，减少有机溶剂。再次加入1或2倍体积的乙酸乙酯，用稀HCl溶液调PH至微酸性，将多肽从DCM层萃取到乙酸乙酯层。用饱和NaCl洗涤2次乙酸乙酯层。用无水硫酸镁吸收乙酸乙酯层的水分。通过减压旋蒸，直接将乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶体状固体多肽，用于下一步C端反应。或通过减压旋蒸保留适量乙酸乙酯的溶液体积，加入冰乙醚析出 多肽，然后对多肽进行烘干操作即可用于下一步C端反应。DABCYL-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-COOH的结构图如下。
7、5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入5.82mmol 5-(2-氨基乙氨基)-1-萘磺酸到树脂中，再加入11.63mmol DIPEA、5.53mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到 DABCYL-Leu-Ala-Gln(Trt)-Ala-Val-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-EDANS。 结构如下：
8、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品DABCYL-Leu-Ala-Gln-Ala-Val-Arg-Ser-Ser-Ser-Arg-EDANS。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
9、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
10、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽
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