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该氨基酸 206 至 225 片段对应于磷酸酶 CDC25C，在 Ser217 位被磷酸化。该肽可用于检查点激酶 CHK1 和 CHK2 检测。

磷酸肽的合成
在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。

目前，多肽的磷酸化修饰方法主要有两种：

（1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
 

1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS 合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点 磷酸化修饰的主要方法。



 

2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：

        采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修 饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难， 尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难 以分离，产率极低。
        因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列 在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要 就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可 以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。

        侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱 除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体， 连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。

磷酸肽的的介绍

在所有的PTM中，磷酸化是最丰富和最重要的修饰之一。磷酸基团是一个高度带负电的分子，在磷原子周围有一个四面体结构。磷酸化多肽主要指肽链中的Ser、Tyr和Thr 残基的侧链羟基被修饰成酸式磷酸酯多肽。许多激素均是通过提高丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的磷酸化状态来调节特异性酶的活性。磷酸化与人类疾病高度相关。例如，tau、α-synuclein和huntingtin的过度/多重磷酸化与人类疾病高度相关，聚集磷酸化也爆发神经退行性疾病的主要原因之一，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。目前，对磷酸化氨基酸的主要研究集中在羟基磷酸单酯型磷酸化氨基酸（O-磷酸化氨基酸），即磷酸化丝氨酸，磷酸化苏氨酸，磷酸化酪氨酸。

专肽生物生物为客户提供pSer、pTyr、pThr和D-pSer、D-pTyr、D-pThr的磷酸化修饰服务，也可以进行二、三、四、五个磷酸化位点修饰的高质量多肽的合成。

Jiang, X. et al. Mol. Canc. Ther. 3: 1221 (2004) O?Neill, T. et al. J. Biol. Chem. 277, 16102 (2002 Davies, S. et al. Biochem. J. 351, 95 (2000) Oh, H. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 5378 (2003).

多肽H2N-Lys-Lys-Lys-Val-Ser-Arg-Ser-Gly-Leu-Tyr-Arg-Ser(PO3H2)-Pro-Ser-Met-Pro-Glu-Asn-Leu-Asn-Arg-Pro-Arg-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克的MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取1.31g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.18mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入2.36mmol DIPEA，1.12mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Val-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(tBu)-Gly-Leu-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Ser(tBu)-Met-Pro-Glu(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Pro-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Lys-Lys-Lys-Val-Ser-Arg-Ser-Gly-Leu-Tyr-Arg-Ser(PO3H2)-Pro-Ser-Met-Pro-Glu-Asn-Leu-Asn-Arg-Pro-Arg-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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