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L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺是氨基肽酶M和亮氨酸氨基肽酶的底物。

L-Leucine 4-methoxy-β-naphthylamide is a substrate for aminopeptidase M and leucine aminopeptidase.

氨基肽酶是催化蛋白质或肽的氨基末端（N端）氨基酸裂解的酶。氨基肽酶广泛分布于动物界和植物界，存在于各种亚细胞器、细胞质以及膜组分中。

Aminopeptidases are enzymes catalyzing the cleavage of amino acids from the amino terminus (N-terminus) of proteins or peptides. Aminopeptidases are distributed widely throughout the animal and plant kingdoms and are present in various subcellular organelles, in cytosol, as well as membrane components.

体外实验：L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺被鉴定为氨基肽酶M和亮氨酸氨基肽酶的可渗透细胞底物，该底物是为蛋白酶活性的细胞内分析而开发的[1]。在先前的一项方法开发研究中，将包括L-亮氨酸4-甲氧基-β-萘酰胺在内的4-甲氧基-β-萘胺的肽衍生物与硝基水杨醛一起在微量滴定板中孵育。通过进行含有对每种肽衍生物具有部分选择性的抑制剂的平行实验来获得选择性。该方法已通过在从组织蛋白酶B-/-、K-/-和L-/-小鼠分离的细胞中的测量得到成功验证[2]。

In vitro: L-Leucine 4-methoxy-β-naphthylamide was identified as a cell-permeable substrate for aminopeptidase M and leucine aminopeptidase that was developed for intracellular analysis of protease activities [1]. In a previous method-developing study, peptide derivatives of 4-methoxy-β-naphthylamine including L-leucine 4-methoxy-β-naphthylamide were incubated in microtiter plates together with nitrosalicylaldehyde. Selectivity was achieved by running parallel assays containing inhibitors partially selective for each of peptide derivatives. This method was successfully validated by measurements in cells isolated from cathepsin B-/--, K-/--, and L-/-- mice [2].

In vivo: Up to now, there is no animal in vivo data reported.

Clinical trial: So far, no clinical study has been conducted.

参考文献:
[1] Monis, B. ,Wasserkrug, H. and Seligman, A.M. Comparison of fixatives and substrates for aminopeptidase. Journal of Histochemistry and Cytochemistry 13(6), 503-509 (1965).
[2] Rüttger, A. ,Mollenhauer, J.,Lser, R., et al. Microplate assay for quantitative determination of cathepsin activities in viable cells using derivatives of 4-methoxy-β-naphthylamide. Biotechniques 41(4), 469-473 (2006).

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

氨基肽酶是一类广泛分布于细菌、真菌、动物和植物中的酶，它们通过水解多肽链N端附近的肽键，催化蛋白质或肽底物氨基末端的氨基酸裂解。大多数氨基肽酶由相对大分子量（50kDa）的亚基组装而成，呈现多聚体结构，而有些则是单聚体。大多数氨基肽酶是锌金属酶，因此会被过渡态类似物bestatin抑制。氨基肽酶存在于许多亚细胞器以及细胞质和膜中，它们参与多种蛋白水解途径，并在蛋白质成熟、非激素和激素肽的降解以及可能决定蛋白质稳定性方面发挥重要作用。

Aminopeptidases are a group of enzymes widely distributed among bacteria, fungi, animals and plants that catalyze the cleavage of amino acids from the amino terminus of protein or peptide substrates through hydrolysis of peptide bonds near the N-terminal end of a polypeptide chain.  Most aminopeptidases are assembled by relatively high mass (50kDa) subunits exhibiting multimeric structures, whereas some are monomeric. The majority of aminopeptidases are zinc metalloenzymes and hence inhibited by the transition-state analog bestatin.  Aminopeptidases have been found in many subcellular organelles as well as in cytoplasm and membrane, where they are involved in diverse proteolytic pathways and play an essential role in protein maturation, degradation of non-hormonal and hormonal peptides and possibly determination of protein stability.