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H-Arg-Arg-AMC hydrochloride salt is a proteolytic inhibitor that binds to the active site of aminopeptidases and prevents their proteolytic activity. This inhibition leads to increased muscle mass in juveniles, as well as higher concentrations of magnesium ions in sarcoplasmic and myofibrillar proteins. H-Arg-Arg-AMC hydrochloride salt also has an inhibitory effect on ion exchange and chloride transport in muscle cells. The biochemical effects of this drug are due to its ability to inhibit the aminopeptidase enzymes, which play a role in the metabolism of amino acids.

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽AMC标记：定义、原理、应用及注意事项全解析

多肽AMC标记，全称多肽7-氨基-4-甲基香豆素标记（Peptide 7-Amino-4-Methylcoumarin Labeling），是一种将荧光分子“AMC”通过特异性共价键连接到多肽特定位点的修饰技术。其核心价值在于为多肽赋予可追踪、可定量的荧光特性，使其成为兼具生物活性与检测功能的“荧光探针”，广泛应用于生物医学科研、酶学分析及药物筛选等领域。

一、核心组件：AMC分子的核心特性

AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）是该标记技术的核心荧光基团，其独特的化学与光学特性决定了标记效果，核心优势包括：

1. 光学性能稳定：激发波长约340-360 nm，发射波长约440-460 nm，荧光量子产率高，光漂白抗性强，且背景荧光低，能有效提升检测灵敏度；

2. 反应活性适配：AMC常以“活性酯衍生物”形式（如AMC-NHS酯、AMC-COOH）存在，可与多肽分子末端（N端/C端）或侧链（如赖氨酸的ε-氨基、天冬氨酸/谷氨酸的羧基）发生酰胺化反应，形成稳定的共价键，且对多肽的空间结构破坏极小；

3. 水溶性适配：AMC分子兼具一定的亲水性与疏水性，标记后不会显著改变多肽的溶解特性，适配后续水性体系的生物实验。

二、标记原理与核心流程

多肽AMC标记的核心是“特异性共价偶联”，需在温和条件下进行以保障多肽生物活性，典型流程如下：

1. 多肽预处理：先通过高效液相色谱（HPLC）等技术纯化目标多肽，去除杂质；同时确认多肽的活性位点（如受体结合位点、酶切位点），避开这些位点选择标记位点（常用N端氨基或C端羧基）；

2. AMC活性酯制备：将AMC与活化试剂（如NHS、DCC）反应，生成高活性的AMC-NHS酯（减少AMC自身聚合，提升与多肽的反应效率）；

3. 偶联反应：在缓冲体系（如PBS缓冲液，pH 7.0-8.0）中混合多肽与AMC活性酯，控制反应温度（25℃或4℃）与时间（2-4小时），让AMC活性酯的活性基团与多肽的氨基/羧基发生酰胺化反应，形成稳定的标记产物；

4. 纯化与验证：通过HPLC分离未反应的游离AMC、活化试剂及副产物，收集高纯度的AMC标记多肽；再通过质谱（确认分子量是否符合标记后理论值）、荧光光谱（验证荧光信号强度）进行质控，确保标记成功且多肽活性未受影响。

三、核心应用场景

AMC标记的核心优势的是“标记后多肽保留生物活性，荧光信号可实时定量检测”，因此主要应用于以下场景：

1. 蛋白酶活性检测（最核心应用）：将AMC标记在多肽底物的蛋白酶特异性识别序列末端，当蛋白酶切割多肽时，AMC基团被释放（游离AMC的荧光强度远高于结合态），通过检测荧光强度的变化速率，可定量分析蛋白酶的活性（如基质金属蛋白酶MMPs、胰蛋白酶、 caspases等的活性检测）；

2. 受体-配体结合分析：用AMC标记多肽配体，与细胞表面或纯化的受体孵育后，通过荧光成像可追踪配体与受体的结合过程，通过荧光强度定量结合亲和力（Kd值）；

3. 药物筛选：针对特定蛋白酶或受体的药物候选分子，以AMC标记多肽为探针，通过荧光信号的变化（如酶活性被抑制时荧光释放减少），高通量筛选药物的抑制/激活活性，评估药物 potency；

4. 多肽体内/体外追踪：AMC标记的多肽进入细胞或生物体内后，可通过荧光显微镜、小动物活体成像系统等设备，实时观察多肽的分布、转运及代谢过程，为多肽药物的药代动力学研究提供支撑。

四、关键注意事项

1. 标记位点选择：必须避开多肽的生物活性中心（如酶切位点、受体结合位点），否则会导致多肽失去原有功能；若多肽含多个氨基/羧基，可通过控制反应摩尔比、pH值实现特异性单点标记；

2. 反应条件控制：缓冲液pH需严格控制在7.0-8.0（过酸会抑制酰胺化反应，过碱会导致AMC活性酯水解失效）；低温反应（4℃）可减少多肽降解，适合不稳定多肽的标记；

3. 杂质去除：游离AMC会导致背景荧光偏高，影响检测准确性，因此标记后需通过HPLC彻底纯化，确保标记多肽纯度≥95%（科研级）或≥98%（药物研发级）；

4. 多肽稳定性保护：若多肽含半胱氨酸（Cys），需在反应体系中添加少量还原剂（如DTT），避免Cys侧链巯基氧化形成二硫键，影响多肽结构与标记效率；

5. 荧光检测条件匹配：检测时需根据AMC的光学特性调整激发/发射波长，避免与实验体系中其他荧光物质（如细胞自身荧光、染料）的光谱重叠，减少干扰。

五、AMC与AFC标记的核心区别（补充说明）

此前你关注过多肽AFC标记，两者核心差异在于荧光基团的结构与性能，具体对比如下：AMC含“甲基（-CH₃）”，AFC含“三氟甲基（-CF₃）”；AFC的背景荧光更低、光稳定性更强，但合成成本更高；AMC性价比更高，荧光信号强度足够满足多数科研需求，是更常用的基础荧光标记基团。

RR-AMC, fluorogenic substrate for dipeptidyl peptidase III (DPP III).