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 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

多肽AMC标记：定义、原理、应用及注意事项全解析

多肽AMC标记，全称多肽7-氨基-4-甲基香豆素标记（Peptide 7-Amino-4-Methylcoumarin Labeling），是一种将荧光分子“AMC”通过特异性共价键连接到多肽特定位点的修饰技术。其核心价值在于为多肽赋予可追踪、可定量的荧光特性，使其成为兼具生物活性与检测功能的“荧光探针”，广泛应用于生物医学科研、酶学分析及药物筛选等领域。

一、核心组件：AMC分子的核心特性

AMC（7-氨基-4-甲基香豆素）是该标记技术的核心荧光基团，其独特的化学与光学特性决定了标记效果，核心优势包括：

1. 光学性能稳定：激发波长约340-360 nm，发射波长约440-460 nm，荧光量子产率高，光漂白抗性强，且背景荧光低，能有效提升检测灵敏度；

2. 反应活性适配：AMC常以“活性酯衍生物”形式（如AMC-NHS酯、AMC-COOH）存在，可与多肽分子末端（N端/C端）或侧链（如赖氨酸的ε-氨基、天冬氨酸/谷氨酸的羧基）发生酰胺化反应，形成稳定的共价键，且对多肽的空间结构破坏极小；

3. 水溶性适配：AMC分子兼具一定的亲水性与疏水性，标记后不会显著改变多肽的溶解特性，适配后续水性体系的生物实验。

二、标记原理与核心流程

多肽AMC标记的核心是“特异性共价偶联”，需在温和条件下进行以保障多肽生物活性，典型流程如下：

1. 多肽预处理：先通过高效液相色谱（HPLC）等技术纯化目标多肽，去除杂质；同时确认多肽的活性位点（如受体结合位点、酶切位点），避开这些位点选择标记位点（常用N端氨基或C端羧基）；

2. AMC活性酯制备：将AMC与活化试剂（如NHS、DCC）反应，生成高活性的AMC-NHS酯（减少AMC自身聚合，提升与多肽的反应效率）；

3. 偶联反应：在缓冲体系（如PBS缓冲液，pH 7.0-8.0）中混合多肽与AMC活性酯，控制反应温度（25℃或4℃）与时间（2-4小时），让AMC活性酯的活性基团与多肽的氨基/羧基发生酰胺化反应，形成稳定的标记产物；

4. 纯化与验证：通过HPLC分离未反应的游离AMC、活化试剂及副产物，收集高纯度的AMC标记多肽；再通过质谱（确认分子量是否符合标记后理论值）、荧光光谱（验证荧光信号强度）进行质控，确保标记成功且多肽活性未受影响。

三、核心应用场景

AMC标记的核心优势的是“标记后多肽保留生物活性，荧光信号可实时定量检测”，因此主要应用于以下场景：

1. 蛋白酶活性检测（最核心应用）：将AMC标记在多肽底物的蛋白酶特异性识别序列末端，当蛋白酶切割多肽时，AMC基团被释放（游离AMC的荧光强度远高于结合态），通过检测荧光强度的变化速率，可定量分析蛋白酶的活性（如基质金属蛋白酶MMPs、胰蛋白酶、 caspases等的活性检测）；

2. 受体-配体结合分析：用AMC标记多肽配体，与细胞表面或纯化的受体孵育后，通过荧光成像可追踪配体与受体的结合过程，通过荧光强度定量结合亲和力（Kd值）；

3. 药物筛选：针对特定蛋白酶或受体的药物候选分子，以AMC标记多肽为探针，通过荧光信号的变化（如酶活性被抑制时荧光释放减少），高通量筛选药物的抑制/激活活性，评估药物 potency；

4. 多肽体内/体外追踪：AMC标记的多肽进入细胞或生物体内后，可通过荧光显微镜、小动物活体成像系统等设备，实时观察多肽的分布、转运及代谢过程，为多肽药物的药代动力学研究提供支撑。

四、关键注意事项

1. 标记位点选择：必须避开多肽的生物活性中心（如酶切位点、受体结合位点），否则会导致多肽失去原有功能；若多肽含多个氨基/羧基，可通过控制反应摩尔比、pH值实现特异性单点标记；

2. 反应条件控制：缓冲液pH需严格控制在7.0-8.0（过酸会抑制酰胺化反应，过碱会导致AMC活性酯水解失效）；低温反应（4℃）可减少多肽降解，适合不稳定多肽的标记；

3. 杂质去除：游离AMC会导致背景荧光偏高，影响检测准确性，因此标记后需通过HPLC彻底纯化，确保标记多肽纯度≥95%（科研级）或≥98%（药物研发级）；

4. 多肽稳定性保护：若多肽含半胱氨酸（Cys），需在反应体系中添加少量还原剂（如DTT），避免Cys侧链巯基氧化形成二硫键，影响多肽结构与标记效率；

5. 荧光检测条件匹配：检测时需根据AMC的光学特性调整激发/发射波长，避免与实验体系中其他荧光物质（如细胞自身荧光、染料）的光谱重叠，减少干扰。

五、AMC与AFC标记的核心区别（补充说明）

此前你关注过多肽AFC标记，两者核心差异在于荧光基团的结构与性能，具体对比如下：AMC含“甲基（-CH₃）”，AFC含“三氟甲基（-CF₃）”；AFC的背景荧光更低、光稳定性更强，但合成成本更高；AMC性价比更高，荧光信号强度足够满足多数科研需求，是更常用的基础荧光标记基团。

Boc-EGR-AMC, substrate for coagulation factors IXa and XIIa as well as for trypsin and soybean trypsin-like enzyme.