专肽生物_定制多肽合成服务_多肽合成定制服务_多肽合成厂家_多肽合成公司

MOCAc-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-D-Arg is a peptide with ion channel activity. It is a potent activator of potassium channels and has been used in research as a tool for studying ion channel function. MOCAc is not an inhibitor of voltage sensitive sodium channels but does inhibit calcium currents. MOCAc also has been shown to be a ligand for the nicotinic acetylcholine receptor and is able to bind to the beta subunit of this receptor. This peptide binds to the alpha subunit of the calcium channel, leading to inhibition of calcium currents and activation of potassium channels.

 Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。

       什么是胱天蛋白酶？

      胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。

      人Caspases酶

      人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。

       表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：

       启动器Caspase和效应器Caspase酶

      根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位

      凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。

       Caspase酶底物和抑制剂

      Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。

       表2. Caspase的底物及其序列

         Caspase酶的显色底物

      Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。

       表3. Caspase的显色底物

       Caspase的荧光底物

      Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。

      图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。

       表4.荧光半胱天冬酶底物。

       注意：

        1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm ^-1M ^-1）。

      2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。

       Caspase抑制剂

      Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。

       表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂

MCA标记肽的说明

(7-Methoxycoumarin-4-yl)acetyl is fluorophor with an excitation at 325 nm ▉ and emission of 392 nm ▉.

MCA标记肽相关文献:

Characterization of the Altai Maral Chymosin Gene, Production of a Chymosin Recombinant Analog in the Prokaryotic Expression System, and Analysis of Its Several Biochemical Properties.
Belenkaya, S. V., A. A. Bondar, T. A. Kurgina, V. V. Elchaninov, A. Yu Bakulina, E. A. Rukhlova, O. I. Lavrik, A. A. Ilyichev, and D. N. Shcherbakov. Biochemistry (Moscow), 2020.

IL-1b is an innate immune sensor of microbial proteolysis.
LaRock, Christopher N., et al. Science Immunology 100.200: 300 (2016).

Mca-GKPILFFRL-Dpa-r-amide, FRET substrate for cathepsin D and E. Also cleaved by napsin A.

多肽MCA-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-Asp-Arg-NH2的合成步骤：

1、合成MBHA树脂：取若干克MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：

2、脱Fmoc：取1.79g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.61mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.22mmol DIPEA，1.53mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

H2N-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHA Resin，结构如下：

5、7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入1.61mmol 7-甲氧基香豆素-4-乙酸(MCA)到树脂中，再加入3.22mmol DIPEA、1.53mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到MCA-Gly-Lys(Boc)-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg(Pbf)-Leu-Lys(Dnp)-Asp(OtBu)-Arg(Pbf)-Linker-MBHAResin。 结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品MCA-Gly-Lys-Pro-Ile-Leu-Phe-Phe-Arg-Leu-Lys(Dnp)-Asp-Arg-NH2。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

以上所有内容，为专肽生物原创内容，请勿发布到其他网站上。