高度表征的单纯疱疹病毒 1 型蛋白酶 (HSV-1) 底物，它对病毒核衣壳形成和病毒复制至关重要。使用 HPLC 测量酶活性以将产物与底物分离并进行定量。用荧光检测器在 280 nm（激发）和 350 nm（发射）处检测 HTYLQASEKFKMWG-酰胺的 C 端切割产物。
编号：200167
CAS号：396716-24-8
单字母：H2N-HTYLQASEKFKMWG-NH2
| 编号: | 200167 |
| 中文名称: | HSV-1酶底物多肽：HSV-1-amide UL 26 Open Reading Frame (2 |
| 英文名: | HSV-1-amide UL 26 Open Reading Frame (242-255) |
| CAS号: | 396716-24-8 |
| 单字母: | H2N-HTYLQASEKFKMWG-NH2 |
| 三字母: | H2N N端氨基 -His组氨酸 -Thr苏氨酸 -Tyr酪氨酸 -Leu亮氨酸 -Gln谷氨酰胺 -Ala丙氨酸 -Ser丝氨酸 -Glu谷氨酸 -Lys赖氨酸 -Phe苯丙氨酸 -Lys赖氨酸 -Met甲硫氨酸 -Trp色氨酸 -Gly甘氨酸 -NH2C端酰胺化 |
| 氨基酸个数: | 14 |
| 分子式: | C80H117N21O20S1 |
| 平均分子量: | 1724.98 |
| 精确分子量: | 1723.85 |
| 等电点(PI): | 10.92 |
| pH=7.0时的净电荷数: | 3.21 |
| 平均亲水性: | -0.33076923076923 |
| 疏水性值: | -0.81 |
| 消光系数: | 6990 |
| 来源: | 人工化学合成，仅限科学研究使用，不得用于人体。 |
| 储存条件: | 负80℃至负20℃ |
| 标签: | 酶底物肽(Substrate Peptide) 病毒学 |
高度表征的单纯疱疹病毒 1 型蛋白酶 (HSV-1) 底物，它对病毒核衣壳形成和病毒复制至关重要。使用 HPLC 测量酶活性以将产物与底物分离并进行定量。用荧光检测器在 280 nm（激发）和 350 nm（发射）处检测 HTYLQASEKFKMWG-酰胺的 C 端切割产物。
Highly characterized substrate for herpes simplex virus type 1 protease (HSV-1), which is essential for viral nucleocapsid formation and for viral replication. Enzyme activity was measured using HPLC for the separation of the products from the substrate and for quantitation. The C-terminal cleavage product of HTYLQASEKFKMWG-amide was detected at 280 nm (excitation) and 350 nm (emission) with a fluorescence detector.
Caspase酶对应的底物，Caspases（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，半胱氨酸依赖性天冬氨酸定向蛋白酶）是一类蛋白酶家族，其功能与凋亡（程序性细胞死亡），坏死和发烧（炎症）的过程密切相关。
什么是胱天蛋白酶？
胱天蛋白酶（Caspases）是含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶，它们是为细胞凋亡的主要介质。多种受体，例如TNF-α 受体，FasL受体，TLR和死亡受体，以及Bcl-2和凋亡抑制剂（IAP）蛋白家族参与并调节该caspase依赖性凋亡途径。一旦Caspase受到上游信号（外部或内在）刺激被激活，即会参与执行下游蛋白底物的水解作用，并触发一系列事件，导致细胞分解，死亡，吞噬作用和细胞碎片的清除。
人Caspases酶
人的Caspases家族基于序列相似性和生物学功能等共性主要可分为三大类：第一类由具有长胱天蛋白酶募集结构域的“炎症”胱天蛋白酶组成，他们对P4位上的较大的芳香族或疏水性残基具有亲和力。第二类由具有短的前体结构域的“细胞凋亡效应”胱天蛋白酶组成，而第三类由具有长的前提结构域的Pap位置具有亮氨酸或缬氨酸底物亲和力的“凋亡引发剂”胱天蛋白酶组成（表1）。
表1. 人胱天蛋白酶的功能分类：
| 细胞死亡途径 | 半胱天冬酶类型 | 酵素 | 物种 |
| 细胞凋亡 | 启动器 | Caspases 2 | 人与鼠 |
| 细胞凋亡 | 启动器 | Caspases 8 | 人与鼠 |
| 细胞凋亡 | 启动器 | Caspases 9 | 人与鼠 |
| 细胞凋亡 | 启动器 | Caspases 10 | 人的 |
| 细胞凋亡 | 效应器 | Caspases 3 | 人与鼠 |
| 细胞凋亡 | 效应器 | Caspases 6 | 人与鼠 |
| 细胞凋亡 | 效应器 | Caspases 6 | 人与鼠 |
| 细胞焦亡 | 炎性的 | Caspases 1 | 人与鼠 |
| 细胞焦亡 | 炎性的 | Caspases 4 | 人的 |
| 细胞焦亡 | 炎性的 | Caspases 5 | 人的 |
启动器Caspase和效应器Caspase酶
根据其在凋亡胱天蛋白酶途径中的作用，胱天蛋白酶可分为两类：启动器和效应器Caspase酶。启动器和效应器Caspas酶都具有由小亚基和大亚基组成的催化位点，Caspase酶的识别位
凋亡启动器Caspase酶，例如caspase-2，-8，-9和-10可以启动caspase激活级联反应。Caspase-8对于形成死亡诱导信号复合物（DISC）是必不可少的，并且在激活后，Caspase-8激活下游效应子Caspase（例如Caspase 3）并介导线粒体中细胞色素c的释放。Caspase-8已被证明对IETD肽序列具有相对较高的底物选择性。凋亡效应胱天蛋白酶例如Caspase-3，-6和-7虽然不负责启动级联途径，但是当被激活时，它们在级联的中间和后续步骤中起着不可或缺的作用。Caspase-3（CPP32 / apopain）是关键效应器，因为它放大了来自启动器Caspase的信号，使用对Caspase-3有选择性的DEVD肽序列对活化的Caspase-3进行检测，可以检测Caspase-3的活性。
Caspase酶底物和抑制剂
Caspase底物和抑制剂由两个关键成分组成：Caspase识别序列和信号产生或蛋白酶抑制基序。不同Caspase识别序列不同，一般由三个或四个氨基酸组成（表2）。Caspase酶识别序列的N端通常有乙酰基（Ac）或碳苯甲氧基（Z）基团修饰，以增强膜的通透性。对应的Caspase识别特定的肽序列为其酶促反应切割位点，释放产生信号或抑制信号的基序。Caspase的显色和荧光底物均以相似的方式起作用，其中底物的信号或颜色强度与蛋白水解活性成正比。
表2. Caspase的底物及其序列
| 多肽 | 氨基酸序列 | 对应的Caspase的种类 |
| IETD | Ile-Glu-Thr-Asp | Caspase 8，颗粒酶B |
| DEVD | Asp-Glu-Val-Asp | Caspase 3、6、7、8或10 |
| LEHD | Leu-Glu-His-Asp | Caspase 9 |
| VAD | Val-Ala-Asp | Caspase 1、2、3、6、8、9或10 |
Caspase酶的显色底物
Caspase的显色底物是有Caspase识别序列及生色基团组成，常见的生色团有pNA（对硝基苯胺或4-硝基苯胺），可使用酶标仪或分光光度计在405 nm处进行光密度检测。
表3. Caspase的显色底物
| 底物 | Caspase | 吸收（nm） | 颜色 |
| Ac-DEVD-pNA * CAS 189950-66-1 * | 半胱天冬酶3 | 405 nm | 黄色 |
| Z-DEVD-pNA | 半胱天冬酶3 | 405 nm | 黄色 |
| Z-IETD-pNA * CAS 219138-21-3 * | 半胱天冬酶8，颗粒酶B | 405 nm | 黄色 |
Caspase的荧光底物
Caspase的荧光底物的结构包含与半胱天冬酶识别相关的荧光团，例如7-氨基-4-甲基香豆素（AMC），7-氨基-4-三氟甲基香豆素（AFC）， Rhodamine 110（R110）或ProRed™620。R110的Caspase底物比基于香豆素的Caspase底物（例如AMC和AFC）更敏感，但由于两步裂解过程，其动态范围更窄。 建议将R110标记的Caspase底物用于终点法测定，而将AMC和AFC标记的 Caspase底物用于动力学测定。
图.从左到右，分别是AMC（7-氨基-4-甲基香豆素），AFC（7-氨基-4-三氟甲基香豆素），Rhodamine 110（R110）和ProRed™620的激发和发射光谱。
表4.荧光半胱天冬酶底物。
| 底物名称 | 对应的Caspase | Ex（nm） | Em（nm） | ε¹ | Φ² |
| Ac-DEVD-AFC * CAS 201608-14-2 * | 半胱天冬酶3、7 | 376 | 482 | 17000 | 0.53 |
| Ac-DEVD-AMC * CAS 169332-61-0 * | 半胱天冬酶3、7 | 341 | 441 | 19000 | N / D |
| Z-DEVD-AFC | 半胱天冬酶3、7 | 376 | 482 | 17000 | 0.53 |
| Z-DEVD-AMC * CAS 1135416-11-3 * | 半胱天冬酶3、7 | 341 | 441 | 19000 | N / D |
| Z-DEVD-ProRed™620 | 半胱天冬酶3、7 | 532 | 619 | N / D | N / D |
| （Z-DEVD）2 -R110 * CAS 223538-61-2 * | 半胱天冬酶3、7 | 500 | 522 | 80000 | N / D |
| Z-DEVD-ProRed™620 | 半胱天冬酶3、7 | 532 | 619 | N / D | N / D |
| Ac-IETD-AFC * CAS 211990-57-7 * | 半胱天冬酶8，颗粒酶B | 376 | 482 | 17000 | 0.53 |
| Z-IETD-AFC * CAS 219138-02-0 * | 半胱天冬酶8，颗粒酶B | 376 | 482 | 17000 | 0.53 |
注意：
1.ε=在其最大吸收波长处的摩尔消光系数（单位= cm -1M -1）。
2.Φ=水性缓冲液（pH 7.2）中的荧光量子产率。
Caspase抑制剂
Caspase抑制剂能与Caspase的活性位点结合并形成可逆或不可逆的连接，通常，Caspase抑制剂的结构由Caspase识别序列，诸如醛（-CHO）或氟甲基酮（-FMK）的官能团组成。具有醛官能团的胱天蛋白酶抑制剂是可逆的，而具有FMK的抑制剂是不可逆的。半胱天冬酶底物和抑制剂都具有较小的细胞毒性作用，因此，它们是研究半胱天冬酶活性的有用工具。
表5. 可逆和不可逆的Caspase酶抑制剂
| 抑制剂 | Caspase的种类 | 是否可逆 | Ex（nm） | Em（nm） |
| Ac-DEVD-CHO * CAS 169332-60-9 * | 半胱天冬酶3、7 | 可逆的 | -- | -- |
| Ac-IETD-CHO * CAS 191338-86-0 * | 半胱天冬酶8 | 可逆的 | -- | -- |
| mFluor™450-VAD-FMK | 半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10 | 不可逆的 | 406 | 445 |
| mFluor™510-VAD-FMK | 半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10 | 不可逆的 | 412 | 505 |
| FITC-C6-DEVD-FMK | 半胱天冬酶3、7 | 不可逆的 | 491 | 516 |
| FITC-C6-DEVD-FMK | 半胱天冬酶3、7 | 不可逆的 | 491 | 516 |
| FITC-C6-LEHD-FMK | 半胱天冬酶9 | 不可逆的 | 491 | 516 |
| FITC-C6-LEHD-FMK | 半胱天冬酶9 | 不可逆的 | 491 | 516 |
| FAM-VAD-FMK | 半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10 | 不可逆的 | 493 | 517 |
| SRB-VAD-FMK [磺胺丁胺B-VAD-FMK] | 半胱天冬酶1，2，3，6，8，9，10 | 不可逆的 | 559 | 577 |
| DOI | 名称 | |
|---|---|---|
| 10.1074/jbc.270.39.22697 | Activation of the herpes simplex virus type 1 protease | 下载 |
多肽H2N-His-Thr-Tyr-Leu-Gln-Ala-Ser-Glu-Lys-Phe-Lys-Met-Trp-Gly-NH2的合成步骤：
1、合成MBHA树脂：取若干克的MBHA树脂（如初始取代度为0.5mmol/g）和1倍树脂摩尔量的Fmoc-Linker-OH加入到反应器中，加入DMF，搅拌使氨基酸完全溶解。再加入树脂2倍量的DIEPA，搅拌混合均匀。再加入树脂0.95倍量的HBTU，搅拌混合均匀。反应3-4小时后，用DMF洗涤3次。用2倍树脂体积的10%乙酸酐/DMF 进行封端30分钟。然后再用DMF洗涤3次，甲醇洗涤2次，DCM洗涤2次，再用甲醇洗涤2次。真空干燥12小时以上，得到干燥的树脂{Fmoc-Linker-MHBA Resin}，测定取代度。这里测得取代度为 0.3mmol/g。结构如下图：
2、脱Fmoc：取1.88g的上述树脂，用DCM或DMF溶胀20分钟。用DMF洗涤2遍。加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Linker-MBHA Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取1.69mmol Fmoc-Gly-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入3.38mmol DIPEA，1.61mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Gly-Linker-MBHA Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
H2N-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
Fmoc-His(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-His(Trt)-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Leu-Gln(Trt)-Ala-Ser(tBu)-Glu(OtBu)-Lys(Boc)-Phe-Lys(Boc)-Met-Trp(Boc)-Gly-Linker-MBHA Resin，结构如下：
5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-His-Thr-Tyr-Leu-Gln-Ala-Ser-Glu-Lys-Phe-Lys-Met-Trp-Gly-NH2。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
7、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。
以上所有内容，为专肽生物原创内容，请勿发布到其他网站上。
