多肽百问百答

1、多肽合成的基本原理?

多肽固相合成法是多肽合成化学的一个重大的突破。它的最大特点是不必纯化中间产物,合成过程可以连续进行,进而为多肽合成的自动化奠定了基础。目前全自动多肽的合成,基本都是固相合成。其基本过程如下:

基于Fmoc化学合成,先将所要合成的目标多肽的C-端氨基酸的羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连,然后以这一氨基酸的氨基作为多肽合成的起点,同其它的氨基酸已经活化的羧基作用形成肽键,不断重复这一过程,即可得到多肽。根据多肽的氨基酸组成不同,多肽后处理方式不同,纯化方式也有差异。


2、做免疫用的多肽多长为合适?

答:一般约10-15个氨基酸,当然长一些免疫效果好一些,不过合成费用也会增加。MAP多肽则希望长度在15aa以上,效果较好。另外,10aa以下的多肽免疫效果比较差。


3、免疫用多肽的纯度需要很高吗?

答:一般而言, 免疫用Peptide,70-85%即可。


4、我们合成的多肽溶解性不好,多肽就有问题对吗?

答:很难准确预测一个多肽的溶解性及合适的溶剂是什么。如果多肽难以溶解就认为多肽合成有问题这个观念并不正确。


5、多肽状态是如何?如何保存储存?

答:我们提供的多肽是粉末状,一般为灰白色,组成不同,多肽粉末的颜色有差异,多肽一般长期保存需要避光保存,并应保存在-20度,短期可以保存在4度。可以短时间的话是以室温运输。


6、如何溶解多肽?

答:溶解多肽是非常复杂的事情,一般很难一下子确定合适的溶剂。通常是先取一点试验,在没有确定合适的溶剂前千万不要全部溶解。

下列方法有助于您选择合适的溶剂:

(1)判定多肽的电荷特定,设定酸性氨基酸Asp(D),Glu(E)和C端COOH为-1;碱性氨基酸Lys(K),Arg(R),His(H)及N端NH2为+1,其它氨基酸的电荷为0。计算出净电荷数。

(2)如果净电荷数 >0,多肽为碱性,用水溶解:如果不溶解或溶解性不大,加入醋酸(10%以上);如果多肽还不能溶解,加入少量TFA(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(3)如果净电荷数<0,多肽为酸性,用水溶解;如果不溶解或溶解性不大,加入氨水(25ul)溶解,然后加入500ul水稀释。

(4)如果净电荷数=0,多肽为中性,一般需要用有机溶剂如乙腈,甲醇或异丙醇,DMSO等溶解。还有人建议需要尿素来溶解疏水性很大的多肽。


7、非HPLC纯化的多肽中有哪些杂质?

答:粗品和脱盐级别的多肽中多肽和非多肽类杂质:如非全长多肽和多肽后处理的一些原料如DTT、TFA等


8、HPLC纯化的多肽有哪些杂质?

答:经过HPLC纯化的多肽,仍会有一些杂质存在,其中的杂质主要是短肽和微量TFA。


9、多长的多肽为合适?

答:多肽合成需要考虑多肽的长度,电荷,亲疏水性等因素。长度越长,合成粗品的纯度和产率都随着降低,纯化的难度和无法合成的几率就会大些。当然多肽功能区的序列是无法改变的,但是为了多肽的顺利合成,有时不得不在功能区的上下游增加一些辅助氨基酸,以改善多肽的溶解性和亲疏水性。如果多肽太短,合成也可能有问题,主要问题是合成的多肽在后处理过程中有一定的难度,5肽以下的多肽,一般要有疏水的氨基酸,否则后处理难度加大。15个氨基酸残基以下的多肽一般都可以得到满意的产率和得率。


10、如何从多肽序列中判定多肽的溶解性?

(1)多肽中如果含有高比例的疏水性很强的氨基酸如和Leu,Val,IIe,Met,Phe和Trp,多肽很难溶解于水性溶液中或根本不可能溶解。这些氨基酸无论是纯化或合成,都有可能有问题。

(2)一般情况下疏水性氨基酸的比例<50%,不能连续5个连续aa为疏水性,带电荷的氨基酸的(正电荷K,R,H,N-terminus,负电荷D,E,C- terminus)的比例达到20%,在多肽的N或C短如果能增加极性氨基酸,也可以改善溶解性。


11、为什么含有Cys,Met,或Trp的多肽难合成?

答:含有Cys, Met,或Trp的多肽难以合成,同时难以获得高纯度的产品。主要因为这些基团不稳定,易氧化。这些多肽的使用和储存都需要特别注意,避免反复开启盖子。


12、为什么有些多肽的合成产率或纯度会比较低?

答:多肽合成与引子合成有比较大的区别,不能合成的引子很少,但是不能合成的多肽经常有。如Val,Ile,Tyr,Phe,Trp,Leu,Gln,和Thr这些氨基酸比邻或重复时,多肽链在合成过程中不能完全舒展溶解,合成效率下降。以下几种情形,合成效率和产物的纯度都比较低,如:重复Pro,Ser-Ser,重复Asp,4个连续Gly等。


13、多肽是如何纯化的?

答:多肽纯化一般使用反相柱(如C8,C18等),214nm。缓冲体系通常为含TFA的溶剂,pH 2.0 。Buffer A为含0.1%TFA in ddH2O,Buffer B为1%TFA/ACN/ pH 2.0。纯化前用Buffer A溶解;如果溶解不好,用Buffer B溶解后,然后用Buffer A稀释;对疏水性强的多肽,有时还需要加入少量的Formic Acid或醋酸。HPLC分析多肽粗产物,如果多肽不长(15aa以下),一般会有主峰,主峰通常为全长产物;对于20aa以上的长肽,如果没有主峰,HPLC需搭配Mass来判定分子量,进而确定哪个峰是所要合成的多肽。


14、茚三酮检测是如何检测的?

固相多肽合成中,主要是通过检测树脂上游离氨基来判断连接效率,检测方法称为Kaiser方法,其检测结果,如果有游离氨基的时候,显示兰色,或红褐色(pro,ser,His)。

Kaiser试剂包括:

A,6% 茚三酮的乙醇溶液

B,80% 苯酚的乙醇溶液

C,2% 0.001M KCN的吡啶溶液

配制中的吡啶需要经过茚三酮处理后,重蒸后再使用。检测过程,取少量树脂,加入A,B,C各2-3滴,100℃下加热1-2min,如果溶液有兰色,或树脂出现兰色,红褐色,表明还有游离氨基,否则说明连接完全。

还有其它检测游离氨基的方法:三硝基苯磺酸法,苦味酸法,溴芬兰法等。


15、困难序列多肽合成的改善方法有哪些?

固相多肽合成中也经常遇到多肽合成失败或合成效率很低的问题,这里面的主要原因是由于多肽序列引起的,因为有些多肽序列在树脂上形成β-折叠,改变了树脂的溶胀性能,还有可能将反应的活性位点埋藏在树脂里面,这样使得反应很难进行,目前报道使用的主要方法有:1,使用混合溶剂,DMSO/DMF,6N 胍啶/DMF溶液。2,提高反应温度,或采用微波方法。3,使用高离液盐,LiCl,NaClO4等。4,使用溶胀性能更好的PEG-PS树脂,同时减少树脂担载量(0.05-0.2mmol/g)。


16,N末端的生物素标记的合成步骤?

Wash 0.1 mmol resin with DMF.

Dissolve 0.244 g (+)-biotin (1 mmol, MW 244.3) in 5 mL DMF-DMSO (1:1) solution. A little warming is necessary.

Add 2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBt solution and 0.3 mL DIEA to the solution prepared in step 2.

Add the activated biotin solution to the resin and let stir overnight.

Check resin to make sure coupling is complete as evidenced by negative ninhydrin test (colorless).

Wash resin with DMF-DMSO (1:1) (2x) to remove excess (+)-biotin.

Wash resin with DMF (2x) and DCM (2x).

Let the resin dry before proceeding to cleavage.


17、2-氯TRT树脂上挂第一个FMOC氨基酸的方法?

Weigh 10 g 2-chlorotrityl chloride resin (15 mmol) in a reaction vessel, wash with DMF (2x), swell the resin in 50 mL DMF for 10 min, drain vessel.

Weigh 10 mmol Fmoc-amino acid in a test tube, dissolve Fmoc-amino acid in 40 mL DMF, transfer the solution into the reaction vessel above, add 8.7 mL DIEA (50 mmol), swirl mixture for 30 min at room temperature.

Add 5 mL methanol into the reaction vessel and swirl for 5 min.

Drain and wash with DMF (5x).

Check substitution.

Add 50 mL 20% piperidine to remove the Fmoc group. Swirl mixture for 30 min.

Wash with DMF (5x), DCM (2x), put resin on tissue paper over a foam pad and let dry at room temperature overnight under the hood. Cover the resin with another piece of tissue paper, press lightly to break aggregates.

Weigh loaded resin.

Pack in appropriate container.


18、检测树脂上面是否挂上第一个FMOC氨基酸的方法?

Weigh duplicate samples of 5 to 10 mg loaded resin in an eppendorf tube, add 1.00 mL 20% piperidine/DMF, shake for 20 min, centrifuge down the resin.

Transfer 100 µL of the above solution into a tube containing 10 mL DMF, mix well.

Pipette 2 mL DMF into each of the two cells (reference cell and sample cell), set spectrophotometer to zero. Empty the sample cell, transfer 2 mL of the solution from step 2 into the sample cell, check absorbance.

Subs = 101(A)/7.8(w)

A = absorbance

w = mg of resin

Check absorbance three times at 301 nm, calculate average substitution.


19、FMOC方法合成多肽操作步骤 (0.25 mmol)?

Wash resin with DMF (4x) and then drain completely.

Add approximately 10 mL 20% piperidine/DMF to resin. Shake for one min and drain.

Add another 10 mL 20% piperidine/DMF. Shake for 30 min.

Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x). Make sure there is no piperidine remaining. Check beads using ninhydrin test, beads should be blue.

Coupling Step - Prepare the following solution:

1 mmol Fmoc-amino acid

2.1 mL 0.45 M HBTU/HOBT (1mmol)

348 µL DIEA (2 mmol)

Add above solution to the resin and shake for a minimum of 30 min. This coupling step can be longer if desired.

Drain reaction vessel and wash resin with DMF (4x).

Perform Ninhydrin test:

If negative (colorless), proceed to step 2 and continue synthesis.

If positive (blue), return to step 5 and re-couple the same Fmoc-amino acid. Increase the coupling time if necessary.

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