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专注多肽 服务科研
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pNA（4-硝基苯胺）衍生的胱天蛋白酶底物广泛用于各种胱天蛋白酶活性和比色检测。胱天蛋白酶切割pNA肽会产生pNA，在~405 nm处进行比色监测。pNA在408nm附近具有最大吸收。Caspase-9底物。
编号：121219
CAS号：921771-40-6
单字母：Ac-LEHD-pNA
| 编号: | 121219 |
| 中文名称: | Caspase 9 Substrate 1, chromogenic |
| 英文名: | Caspase 9 Substrate 1, chromogenic |
| CAS号: | 921771-40-6 |
| 单字母: | Ac-LEHD-pNA |
| 三字母: | Ac N端乙酰化封端，一种常见的修饰方式，常用于模拟蛋白质中的肽片段。 -LeuL-亮氨酸：leucine。系统命名为(2S)-氨基-4-甲基戊酸。是编码氨基酸。是哺乳动物的必需氨基酸。符号：L，Leu。 -GluL-谷氨酸：glutamic acid。系统命名为(2S)-氨基-戊二酸。是编码氨基酸。符号：E，Glu。D-谷氨酸存在于多种细菌的细胞壁和某些细菌杆菌肽中。 -HisL-组氨酸：histidine。系统命名为(2S)-氨基-3-(4-咪唑基)丙酸。其侧链带有弱碱性的咪唑基，为编码氨基酸。是幼小哺乳动物的必需氨基酸。符号：H，His。 -AspL-天冬氨酸：aspartic acid。系统命名为(2S)-氨基-丁二酸。是编码氨基酸，又是神经递质。符号：D，Asp。D-天冬氨酸存在于多种细菌的细胞壁和短杆菌肽A中。 -pNA对硝基苯胺 |
| 氨基酸个数: | 4 |
| 分子式: | C29H38O11N8 |
| 平均分子量: | 674.66 |
| 精确分子量: | 674.27 |
| 等电点(PI): | 4 |
| pH=7.0时的净电荷数: | -1.76 |
| 平均亲水性: | 0.925 |
| 疏水性值: | -1.6 |
| 外观与性状: | 白色粉末状固体 |
| 消光系数: | - |
| 来源: | 人工化学合成，仅限科学研究使用，不得用于人体。 |
| 纯度: | 95%、98% |
| 盐体系: | 可选TFA、HAc、HCl或其它 |
| 储存条件: | 负80℃至负20℃ |
| 标签: | pNA修饰肽 |
| 参考文献（References）: | Grutter MG (2000) Curr Opin Struct Biol 10, 649-55 Gastman BR (2001) Head Neck 23, 409-25 Grutter MG (2000) Curr Opin Struct Biol 10, 649-55 Stennicke HR and Salvesen GS (1999)Cell Death Differ 6, 1054-9 Stennicke HR and Salvesen GS (1998) Biochim Biophys Acta 1387, 17-31 Thornberry NA and Lazebnik Y (1998) Science 281, 1312-6 Talanian RV, et al. (1997) . J Biol Chem 272, 9677-82. Fassy F, et al. (1998) Eur J Biochem 253, 76-83, Datta R, et al. (1996) Blood 88, 1936-43 Koeplinger KA, et al. (2000) Protein Expr Purif 18, 378-87 |
pNA（4-硝基苯胺）衍生的胱天蛋白酶底物广泛用于各种胱天蛋白酶活性和比色检测。胱天蛋白酶切割pNA肽会产生pNA，在~405 nm处进行比色监测。pNA在408nm附近具有最大吸收。Caspase-9底物。
pNA (4-nitroaniline)-derived caspase substrates widely used for various caspase activities and colorimetric detection. Cleavage of pNA peptides by caspases generates pNA that is monitored colorimetrically at ~405 nm. pNA has maximum absorption around 408 nm. Caspase-9 substrate.
对硝基苯胺衍生的半胱天冬酶底物广泛用于比色检测各种半胱天冬酶活性。半胱天冬酶切割对硝基苯胺多肽产生对硝基苯胺，在约 405 纳米处进行比色监测。对硝基苯胺在 408 纳米附近有最大吸收。
pNA (4-nitroaniline)-derived caspase substrates are widely used for the colorimetric detection of various caspase activities. Cleavage of pNA peptides by caspases generates pNA that is monitored colorimetrically at ~405 nm. pNA has maximum absorption around 408 nm.
Ac-LEHD-pNA 是一种Caspase-9底物； pNA（4-硝基苯胺）衍生的 caspase 底物广泛用于各种 caspase 活性的比色检测。半胱天冬酶裂解 pNA 肽产生 pNA，并在 ~405 nm 处进行比色监测。 pNA 在 408 nm 附近有最大吸收。
多肽Ac-Leu-Glu-His-Asp-pNA的合成步骤：
1、合成CTC树脂：称取2.33g CTC Resin（如初始取代度约为0.92mmol/g）和2.57mmol Fmoc-Asp(OtBu)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入6.43mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到 Fmoc-Asp(OtBu)-CTC Resin。结构图如下：
2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Asp(OtBu)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：
3、缩合：取6.43mmol Fmoc-His(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入12.86mmol DIPEA，6.11mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：
4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到
H2N-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin
Fmoc-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin
H2N-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin
Fmoc-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin
以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。
最后再经过步骤二得到 H2N-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin，结构如下：
5、乙酸酐反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入6.43mmol 乙酸酐到树脂中，再加入12.86mmol DIPEA、6.11mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Ac-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 结构如下：
6、全保护切割：配置0.5%TFA/DCM溶液，溶液体积约为树脂体积的3倍。再次用DCM洗涤树脂2遍（去除残留DMF），后将配置好的溶液倒入到反应器中，反应30分钟。抽滤树脂，收集滤液（此时多肽已经从树脂上分离，存在于滤液中）。多肽序列为 Ac-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-CTC Resin。 在滤液中添加DIEPA，调PH至7-8。用饱和NaHCO3洗涤滤液，分离出DCM层溶液。可适当旋蒸DCM层溶液，减少有机溶剂。再次加入1或2倍体积的乙酸乙酯，用稀HCl溶液调PH至微酸性，将多肽从DCM层萃取到乙酸乙酯层。用饱和NaCl洗涤2次乙酸乙酯层。用无水硫酸镁吸收乙酸乙酯层的水分。通过减压旋蒸，直接将乙酸乙酯完全旋蒸掉，得到晶体状固体多肽，用于下一步C端反应。或通过减压旋蒸保留适量乙酸乙酯的溶液体积，加入冰乙醚析出 多肽，然后对多肽进行烘干操作即可用于下一步C端反应。Ac-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-COOH的结构图如下。
7、4-硝基苯胺反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入6.43mmol 4-硝基苯胺到树脂中，再加入12.86mmol DIPEA、6.11mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到 Ac-Leu-Glu(OtBu)-His(Trt)-Asp(OtBu)-pNA。 结构如下：
8、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Ac-Leu-Glu-His-Asp-pNA。结构图见产品结构图。
切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%
2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%
3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%
（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）
9、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。
10、最后总结：
杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽
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