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生物素可以与亲和素或者链霉亲和素有力结合，结合强度甚至接近共价键。生物素标记的肽通常用于免疫测定，组织细胞化学和基于荧光的流式细胞术。标记的抗生物素抗体也可以用来结合生物素化多肽。生物素标记常连接在赖氨酸侧链或者N末端。通常在多肽和生物素之间使用6-氨基己酸作为纽带，纽带能够灵活结合底物，并且在有空间位阻的情况下能结合地更好。专肽生物根据需求，向客户提供具有不同位点生物素标记多肽的定制合成。

专肽生物合成用于蛋白质-蛋白质相互作用研究的生物素化肽。尽管生物素可以在 N 端或 C 端引入（通过赖氨酸残基），但我们建议使用 N 端修饰，因为它成本低、成功率高、周转时间短且易于操作。因为多肽合成是从 C 端到 N 端合成的，因此，N 端修饰是 SPPS步骤的最后一步，不需要额外的特定缩合步骤。相比之下，C 端修饰需要额外的步骤，并且通常更复杂。当然，原则上生物素可以定位在任何地方。

生物素可以通过多种不同的接头或间隔物与肽分离。尽管如此，还是建议包含一个灵活的间隔物，例如 Ahx（一个 6 碳接头），以使生物素标签更加稳定或灵活。

专肽生物在 N 端或 C 端提供生物素化：生物素-N 端、赖氨酸-生物素-肽中间和赖氨酸-生物素-C 端。
专肽生物还可以使用 Ahx 接头或长碳 (LC) 接头提供生物素化：生物素-Ahx-N 末端、Lys-Ahx-生物素-肽中间、Lys-Ahx-生物素-C-末端。

（生物素结构）

示例：
GRGDS在N端和C端标记生物素的结构展示。

1、GRGDS在N端标记生物素，不增加Ahx 接头

2、GRGDS在N端标记生物素，增加一个Ahx 接头

3、GRGDS在C端标记生物素，不增加Ahx 接头

4、GRGDS在C端标记生物素，增加一个Ahx 接头。

磷酸肽的合成
在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。

目前，多肽的磷酸化修饰方法主要有两种：

（1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
 

1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS 合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点 磷酸化修饰的主要方法。



 

2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：

        采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修 饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难， 尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难 以分离，产率极低。
        因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列 在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要 就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可 以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。

        侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱 除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体， 连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。

磷酸肽的的介绍

在所有的PTM中，磷酸化是最丰富和最重要的修饰之一。磷酸基团是一个高度带负电的分子，在磷原子周围有一个四面体结构。磷酸化多肽主要指肽链中的Ser、Tyr和Thr 残基的侧链羟基被修饰成酸式磷酸酯多肽。许多激素均是通过提高丝氨酸（Ser）或苏氨酸（Thr）残基的磷酸化状态来调节特异性酶的活性。磷酸化与人类疾病高度相关。例如，tau、α-synuclein和huntingtin的过度/多重磷酸化与人类疾病高度相关，聚集磷酸化也爆发神经退行性疾病的主要原因之一，例如阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和亨廷顿氏病。目前，对磷酸化氨基酸的主要研究集中在羟基磷酸单酯型磷酸化氨基酸（O-磷酸化氨基酸），即磷酸化丝氨酸，磷酸化苏氨酸，磷酸化酪氨酸。

专肽生物生物为客户提供pSer、pTyr、pThr和D-pSer、D-pTyr、D-pThr的磷酸化修饰服务，也可以进行二、三、四、五个磷酸化位点修饰的高质量多肽的合成。

多肽Biotin-Arg-Arg-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.96g CTC Resin（如初始取代度约为0.87mmol/g）和2.05mmol Fmoc-Leu-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入5.12mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Leu-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Leu-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取5.12mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入10.23mmol DIPEA，4.86mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTC Resin，结构如下：

5、生物素反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入5.12mmol 生物素到树脂中，再加入10.23mmol DIPEA、4.86mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到Biotin-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Ala-Ala-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Leu-Asp(OtBu)-Ser(tBu)-Arg(Pbf)-Ala-Gly-Ser(HPO3Bzl)-Pro-Gln(Trt)-Leu-CTCResin。 结构如下：

6、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品Biotin-Arg-Arg-Ala-Ala-Glu-Glu-Leu-Asp-Ser-Arg-Ala-Gly-Ser(PO3H2)-Pro-Gln-Leu-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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