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血管内皮细胞生长因子（VEGF）是一种蛋白酪氨酸激酶，也是血管生成的著名介质，其主要通过血管内皮生长因子受体家族（VEGFR1、2、3；神经纤毛蛋白 1）介导。目前有大量证据表明，VEGFR 家族可作为癌症治疗的有力靶点。通常，VEGF 和 VEGFR 的过度表达与多种恶性肿瘤的侵袭和转移有关，包括结直肠癌、乳腺癌和非小细胞肺癌。

乔尔达诺等人提出了“生物淘选及选择性相互作用配体的快速分析”（简称 BRASIL）这一新方法，用于高亲和力肽的筛选、选择和分选。该方法的创新之处在于增加了基于差速离心的细胞表面结合肽分选步骤。首先将细胞悬液与噬菌体在水相上层中孵育，然后通过不相溶的有机下层进行离心。乔尔达诺及其同事声称，这种单步有机相分离法比目前主要依赖多次洗涤步骤或有限稀释的方法更快，且灵敏度和特异性更高。以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）作为筛选对象，他们从饥饿状态的 HUVEC 和血管内皮生长因子（VEGF）刺激后的 HUVEC 中分离出 21 个结合的噬菌体克隆。其中 14 个克隆（67%）在 VEGF 刺激后结合能力增强超过 150%（范围为 1.5 至 8.7 倍；中位数为 2.2 倍）。从所选噬菌体中随机选取 34 个克隆进行序列比对分析，结果显示通过 BRASIL 选择回收的噬菌体中有 24 个克隆（70%）具有可完美匹配血管内皮生长因子家族成员序列的肽基序。他们选取了两个肽（CPQPRPLC 和 CNIRRQGC）用于体外血管内皮生长因子受体-1（VEGFR - 1）的结合试验。其中一个被选中的肽 CPQPRPLC 磁珠与 VEGFR 的结合量比对照组高出 1000 多倍。

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。