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磷酸肽
在生命过程中发挥重要作用，磷酸化的位置在多肽上的Tyr、Ser，Thr，。目前磷酸肽合成一般都采用磷酸化氨基酸，目前使用的都是单苄基磷酸化氨基酸。磷酸化氨基酸的连接一般采用HBTU/HOBt/DIEA方法，但是目前采用该方法合成磷酸化多肽也有缺点，特别是在合成多磷酸化多肽或氨基酸较长的多肽的时候，连接效率低，最后产品纯度很低，对于这种磷酸化多肽，我们考虑采用后磷酸化方法，其合成过程就是在多肽合成结束后，选择性脱去要标记的氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应，而Ser可以采用Fmoc-Ser（trt），在1% TFA/DCM条件下可以定量的脱除。
       后磷酸化，采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，随后在过氧酸下氧化生成磷酰基，完成反应。
 

目前，多肽的磷酸化修饰方法主要有两种：

（1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中；

（2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化。
 

1）将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中：

即事先将需要磷酸化的氨基酸（Thr,Ser或Tyr）磷酸化并适当保护，然后按照正常SPPS 合成流程将磷酸化单体缩合到多肽指定位点。这种方法操作简便，已经成为多肽单位点 磷酸化修饰的主要方法。



 

2）多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：

        采用将磷酸化单体缩合到多肽中的方法进行磷酸化修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修 饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难， 尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难 以分离，产率极低。
        因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用将多肽序列 在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化：其合成过程主要 就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可 以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。

        侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱 除。采用这种方法时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体， 连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。

多肽荧光标记由于没有放射性，实验操作简单。因此，目前在生物学研究中多肽荧光标记应用非常广泛，多肽荧光标记方法与荧光试剂的结构有关系，对于有游离羧基的采用的方法与接多肽反应相同，也采用HBTU/HOBt/DIEA方法连接。 在N端标记FITC的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的多肽从树脂上切下来时，这种情况可避免在切割的过程中被TFA切割掉。
        人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将 其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病治疗靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激 酶、磷酸酶、肽酶等）。
        专肽生物能够提供技术成熟的各种荧光标记多肽。
 

下面是一些常见的多肽修饰荧光物质结构：




FITC标记
 

      FITC(异硫氰酸荧光素)具有比较高的活性，我们公司可以通过两种方式将FITC标记于多肽 上：(1) 将FITC标记于赖氨酸（Lys）或被选择性地脱保护的鸟氨酸（ornithine）侧链氨基 上；(2) 将FITC标记于多肽N端氨基。

      当在N端标记时，建议在最后一个氨基和由异硫氰酸酯与氨基反应产生的硫脲键之间引入 烷基间隔器（alkyl spacer），如氨基己酸（Ahx）。链接切割需要酸性环境，在N端标记FITC 的多肽需经历环化作用来形成荧光素，通常会伴有最后一个氨基酸的去除，但当有一个间隔器 如氨基己酸，或者是通过非酸性环境将目的肽从树脂上切下来时，这种情况可避免。空间位阻 被认为是在荧光染料前使用Ahx的主要原因，而不是为什么FITC不能直接偶联在多肽上的原因。

      Ahx或b-Ala均可作为间隔器用于FITC标记的多肽上。

普通荧光修饰

通过Lys侧链氨基连接的荧光修饰

专肽常做的荧光物质的激发光波长和发射光波长。可供参考选择：
 

多肽5TAMRA-Lys-Lys-Leu-Asn-Arg-Thr-Leu-Ser(PO3H2)-Val-Ala-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.27g CTC Resin（如初始取代度约为0.33mmol/g）和0.5mmol Fmoc-Ala-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入1.26mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Ala-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Ala-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取1.26mmol Fmoc-Val-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入2.51mmol DIPEA，1.19mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Val-Ala-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTC Resin，结构如下：

5、5-羧基四甲基罗丹明反应连接：在上述树脂中，加入适当DMF后，再加入1.26mmol 5-羧基四甲基罗丹明到树脂中，再加入2.51mmol DIPEA、1.19mmol HBTU，鼓氮气反应30分钟。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。 得到5TAMRA-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Leu-Asn(Trt)-Arg(Pbf)-Thr(tBu)-Leu-Ser(HPO3Bzl)-Val-Ala-CTCResin。 结构如下：

6、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品5TAMRA-Lys-Lys-Leu-Asn-Arg-Thr-Leu-Ser(PO3H2)-Val-Ala-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%、TFA：H2O=97.5%：2.5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽

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