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Definition

Chlorotoxin is a 36-amino acid peptide found in the venom of the death-stalker scorpion (Leiurus quinquestriatus) which blocks small-conductance chloride channels1.

Discovery

Chlorotoxin was first purified from scorpion venum in 19931.

Classification

Chlorotoxin belongs to the scorpion toxin superfamily1.

Structural Characteristics

Chlorotoxin is a small positive charged peptide consisting of 30-35 amino acids and 4 disulfide bonds2. Eight cysteine amino acids among its total number of amino acids present in the structure of this peptide are connected with four disulfide bonds2.

Mode of action

Chlorotoxin specifically binds to matrix-metalloproteinase receptor on glioma cells and inhibits it3. It also acts as a ligand for chloride channels and blocks them4.

Functions

As chlorotoxin binds preferentially to glioma cells compared with non-neoplastic cells or normal brain it has has been used to develop new methods for the treatment and diagnosis of several types of cancer5.  Chlorotoxin: Cy5.5 bioconjugate has been recently used to demarcate cancer cells from the surrounding normal cells. This gives surgeons a better chance of removing all of the cancerous cells without injuring the surrounding healthy tissue6.

References                                      

1.     DeBin JA, Maggio JE, Strichartz GR (1993). Purification and characterization of chlorotoxin, a chloride channel ligand from the venom of the scorpion. Am. J. Physiol., 264 (2 Pt 1), C361–9.

2.     Lippens G, Najib J, Wodak SJ, Tartar A (1995). NMR sequential assignments and solution structure of chlorotoxin, a small scorpion toxin that blocks chloride channels. Biochemistry, 34 (1): 13–21.

3.     Deshane J, Garner CC, Sontheimer H (2003). Chlorotoxin inhibits glioma cell invasion via matrix metalloproteinase-2. J. Biol. Chem., 278 (6), 4135–44.

4.     DeBin JA, Strichartz GR (1991). Chloride channel inhibition by the venom of the scorpion Leiurus quinquestriatue. Toxicon, 29 (11), 1403–8.

5.     Lyons SA, O'Neal J, Sontheimer H (2002). Chlorotoxin, a scorpion-derived peptide, specifically binds to gliomas and tumors of neuroectodermal origin. Glia 39 (2), 162–73.

6.     Veiseh M, Gabikian P, Bahrami SB, et al (2007). Tumor paint: a chlorotoxin: Cy5.5 bioconjugate for intraoperative visualization of cancer foci. Cancer Res., 67 (14), 6882–8.

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。

化学预防肽是有助于预防疾病（例如癌症或糖尿病）的发作或发展的肽。这些肽可以源自天然来源，例如大豆或牛奶，也可以来自肽模拟物的设计，也可以源自使用合成肽进行的肽筛选。据认为，这些肽中的某些可以充当细胞周期的调节剂，其调节使细胞通过复制周期前进所需的蛋白质的产生和功能。另外，现在有越来越多的证据表明特定的饮食模式，食物和饮料以及其他饮食物质可以而且确实可以预防癌症。越来越多的流行病学研究表明，食物，营养和身体活动在预防和改变癌症过程中很重要。包括植物蛋白酶抑制剂，乳铁蛋白，乳铁蛋白，凝集素和lunasin在内的不同类型的食物蛋白和多肽似乎起着化学预防剂的作用。如今，蛋白质和多肽被认为是一组营养保健品，在预防癌症的不同阶段（包括起始，促进和进展）方面显示出潜力。此外，已经发现在植物中发现的一些蛋白酶抑制剂，例如豆类和大豆，是有效的癌发生抑制剂。致癌作用是引发和促进癌症的过程。 Bowman-Birk抑制剂和Kunitz胰蛋白酶抑制剂就在其中。目前，这些化合物在致癌作用中的生物学功能主要归因于抑制癌细胞的侵袭和转移，但是，其作用机理仍不完全清楚，需要进一步研究以充分阐明它们。

多肽H2N-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Lys-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取1.88g CTC Resin（如初始取代度约为0.92mmol/g）和2.08mmol Fmoc-Arg(Pbf)-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入5.19mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Arg(Pbf)-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Arg(Pbf)-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取5.19mmol Fmoc-Cys(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入10.38mmol DIPEA，4.93mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

Fmoc-Met-Cys(Trt)-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Met-Cys(Trt)-Met-Pro-Cys(Trt)-Phe-Thr(tBu)-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-His(Trt)-Gln(Trt)-Met-Ala-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Asp(OtBu)-Asp(OtBu)-Cys(Trt)-Cys(Trt)-Gly-Gly-Lys(Boc)-Gly-Arg(Pbf)-Gly-Lys(Boc)-Cys(Trt)-Tyr(tBu)-Gly-Pro-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Leu-Cys(Trt)-Arg(Pbf)-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Met-Cys-Met-Pro-Cys-Phe-Thr-Thr-Asp-His-Gln-Met-Ala-Arg-Lys-Cys-Asp-Asp-Cys-Cys-Gly-Gly-Lys-Gly-Arg-Gly-Lys-Cys-Tyr-Gly-Pro-Gln-Cys-Leu-Cys-Arg-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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