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MCH是内源性黑色素浓度激素受体激动剂，在MCH1和MCH2受体处的IC50值分别为0.3和1.5nM。它可以增加体内的食物摄入量。

MCH is an endogenous melanin-concentration hormone receptor agonist with IC50 values of 0.3 and 1.5 nM at MCH1 and MCH2 receptors respectively. It can increase food intake in vivo.

二硫键广泛存在与蛋白结构中，对稳定蛋白结构具有非常重要的意义，二硫键一般是通过序列中的2个Cys的巯基，经氧化形成。
 

形成二硫键的方法很多：空气氧化法，DMSO氧化法，过氧化氢氧化法等。
 

二硫键的合成过程，  可以通过Ellman检测以及HPLC检测方法对其反应进程进行监测。  
   

如果多肽中只含有1对Cys，那二硫键的形成是简单的。多肽经固相或液相合成，然后在pH8-9的溶液中进行氧化。      
 

当需要形成2对或2对以上的二硫键时，合成过程则相对复杂。尽管二硫键的形成通常是在合成方案的最后阶段完成，但有时引入预先形成的二硫化物是有利于连合或延长肽链的。通常采用的巯基保护基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。我们分别列出两种以2-Cl树脂和Rink树脂为载体合成的多肽上多对二硫键形成路线：
 

二硫键反应条件选择    
 

 二硫键即为蛋白质或多肽分子中两个不同位点Cys的巯基（-SH）被氧化形成的S-S共价键。 一条肽链上不同位置的氨基酸之间形成的二硫键，可以将肽链折叠成特定的空间结构。多肽分 子通常分子量较大，空间结构复杂，结构中形成二硫键时要求两个半胱氨酸在空间距离上接近。 此外，多肽结构中还原态的巯基化学性质活泼，容易发生其他的副反应，而且肽链上其他侧链 也可能会发生一系列修饰，因此，肽链进行修饰所选取的氧化剂和氧化条件是反应的关键因素， 反应机理也比较复杂，既可能是自由基反应，也可能是离子反应。      

反应条件有多种选择，比如空气氧化，DMSO氧化等温和的氧化过程，也可以采用H2O2，I2， 汞盐等激烈的反应条件。
 

空气氧化法： 空气氧化法形成二硫键是多肽合成中最经典的方法，通常是将巯基处于还原态的多肽溶于水中，在近中性或弱碱性条件下（PH值6.5-10），反应24小时以上。为了降低分子之间二硫键形成的可能，该方法通常需要在低浓度条件下进行。
 

碘氧化法：将多肽溶于25%的甲醇水溶液或30%的醋酸水溶液中，逐滴滴加10-15mol/L的碘进行氧化，反应15-40min。当肽链中含有对碘比较敏感的Tyr、Trp、Met和His的残基时，氧化条件要控制的更精确，氧化完后，立即加入维生素C或硫代硫酸钠除去过量的碘。 当序列中有两对或多对二硫键需要成环时，通常有两种情况：
 

自然随机成环:       序列中的Cys之间随机成环，与一对二硫键成环条件相似；
 

定点成环：       定点成环即序列中的Cys按照设计要求形成二硫键，反应过程相对复杂。在 固相合成多肽之前，需要提前设计几对二硫键形成的顺序和方法路线，选择不同的侧链 巯基保护基，利用其性质差异，分步氧化形成两对或多对二硫键。       通常采用的巯基保护 基有trt, Acm, Mmt, tBu, Bzl, Mob, Tmob等多种基团。

多肽H2N-Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-COOH的合成步骤：

1、合成CTC树脂：称取2.13g CTC Resin（如初始取代度约为0.34mmol/g）和0.87mmol Fmoc-Val-OH于反应器中，加入适量DCM溶解氨基酸（需要注意，此时CTC树脂体积会增大好几倍，避免DCM溶液过少），再加入2.17mmol DIPEA（Mw：129.1,d：0.740g/ml），反应2-3小时后，可不抽滤溶液，直接加入1ml的HPLC级甲醇，封端半小时。依次用DMF洗涤2次，甲醇洗涤1次，DCM洗涤一次，甲醇洗涤一次，DCM洗涤一次，DMF洗涤2次（这里使用甲醇和DCM交替洗涤，是为了更好地去除其他溶质，有利于后续反应）。得到  Fmoc-Val-CTC Resin。结构图如下：

2、脱Fmoc：加3倍树脂体积的20%Pip/DMF溶液，鼓氮气30分钟，然后2倍树脂体积的DMF 洗涤5次。得到 H2N-Val-CTC Resin 。（此步骤脱除Fmoc基团，茚三酮检测为蓝色，Pip为哌啶）。结构图如下：

3、缩合：取2.17mmol Fmoc-Gln(Trt)-OH 氨基酸，加入到上述树脂里，加适当DMF溶解氨基酸，再依次加入4.35mmol DIPEA，2.06mmol HBTU。反应30分钟后，取小样洗涤，茚三酮检测为无色。用2倍树脂体积的DMF 洗涤3次树脂。（洗涤树脂，去掉残留溶剂，为下一步反应做准备）。得到Fmoc-Gln(Trt)-Val-CTC Resin。氨基酸：DIPEA：HBTU：树脂=3：6：2.85：1（摩尔比）。结构图如下：

4、依次循环步骤二、步骤三，依次得到

H2N-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Phe-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

H2N-Phe-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

Fmoc-Asp(OtBu)-Phe-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin

以上中间结构，均可在专肽生物多肽计算器-多肽结构计算器中，一键画出。

最后再经过步骤二得到 H2N-Asp(OtBu)-Phe-Asp(OtBu)-Met-Leu-Arg(Pbf)-Cys(Trt)-Met-Leu-Gly-Arg(Pbf)-Val-Tyr(tBu)-Arg(Pbf)-Pro-Cys(Trt)-Trp(Boc)-Gln(Trt)-Val-CTC Resin，结构如下：

5、切割：6倍树脂体积的切割液（或每1g树脂加8ml左右的切割液），摇床摇晃 2小时，过滤掉树脂，用冰无水乙醚沉淀滤液，并用冰无水乙醚洗涤沉淀物3次，最后将沉淀物放真空干燥釜中，常温干燥24小试，得到粗品H2N-Asp-Phe-Asp-Met-Leu-Arg-Cys-Met-Leu-Gly-Arg-Val-Tyr-Arg-Pro-Cys-Trp-Gln-Val-COOH。结构图见产品结构图。

切割液选择：1）TFA：H2O=95%：5%

2）TFA：H2O：TIS=95%：2.5%：2.5%

3）三氟乙酸：茴香硫醚：1，2-乙二硫醇：苯酚：水=87.5%：5%：2.5%：2.5%：2.5%

（前两种适合没有容易氧化的氨基酸，例如Trp、Cys、Met。第三种适合几乎所有的序列。）

6、纯化冻干：使用液相色谱纯化，收集目标峰液体，进行冻干，获得蓬松的粉末状固体多肽。不过这时要取小样复测下纯度 是否目标纯度。

7、最后总结：

杭州专肽生物技术有限公司（ALLPEPTIDE https://www.allpeptide.com）主营定制多肽合成业务，提供各类长肽，短肽，环肽，提供各类修饰肽，如：荧光标记修饰（CY3、CY5、CY5.5、CY7、FAM、FITC、Rhodamine B、TAMRA等），功能基团修饰肽（叠氮、炔基、DBCO、DOTA、NOTA等），同位素标记肽（N15、C13），订书肽（Stapled Peptide）,脂肪酸修饰肽（Pal、Myr、Ste），磷酸化修饰肽（P-Ser、P-Thr、P-Tyr），环肽（酰胺键环肽、一对或者多对二硫键环），生物素标记肽，PEG修饰肽，甲基化修饰肽等。

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